1、作者单位:.哈尔滨医科大学附属肿瘤医院乳腺外科一病区(哈尔滨).哈尔滨医科大学附属肿瘤医院门诊手术室作者简介:隋世尧男()博士副主任医师从事乳腺肿瘤的铁死亡机制研究通信作者:庞达 :.通过 轴抑制乳腺癌细胞铁死亡隋世尧 郑玮 杨子涵 庞达【摘要】目的 探讨 在乳腺癌中的表达以及调控乳腺癌细胞铁死亡的作用机制 方法 收集 年 月 年 月于我院乳腺外科进行手术治疗的 例乳腺癌患者癌组织及距肿瘤边缘 的癌旁组织应用 技术分析 在乳腺癌组织及配对癌旁组织中的表达 构建 敲降的乳腺癌 细胞系及过表达 的乳腺癌 细胞系 法测定 对乳腺癌细胞增殖能力的影响应用铁含量测定试剂盒及 测定试剂盒检测铁及 改变 实
2、验检测 及 蛋白表达分析 与 及 与 表达的相关性 结果 在乳腺癌组织中表达高于癌旁组织(.)且在侵袭转移能力强的 型及()乳腺癌中高表达(.)高表达与乳腺癌患者的总生存期()及无病生存期()短相关(.)敲降 导致细胞活力降低(.)且该作用可被铁死亡抑制剂逆转 机制方面 通过上调 表达抑制铁死亡 上游可受到组蛋白乙酰基转移酶 的正向调控 与 的表达正相关(.)结论 在乳腺癌中高表达且可通过 轴抑制乳腺癌细胞铁死亡【关键词】乳腺癌铁死亡谷胱甘肽过氧化物酶 【中图分类号】.【文献标识码】:./.【】.(.)()(.).()()(.).(.).(.).【】()乳腺癌已成为威胁女性健康的头号杀手其发病
3、率位居女性恶性肿瘤第一位致死率位居第二实用肿瘤学杂志 年第 卷第 期总第 期位仅次于肺癌故乳腺癌的早诊早治迫在眉睫铁死亡()这一概念由 及其同事于 年提出依赖于细胞内活性氧()水平而与凋亡完全不同其促进剂能够有效杀伤凋亡抵抗的癌细胞 谷胱甘肽过氧化物酶()催化铁死亡过程中谷胱甘肽中和 反应已被证实是铁死亡过程中的关键酶并与肿瘤的发生发展密切相关其抑制剂 已被证实可杀伤乳腺癌细胞并可协同增强顺铂对肺癌细胞的杀伤作用长链非编码()是一类长度为 的非编码 分子其家族成员 位于第 号染色体上全长 在肿瘤领域 被广泛认为是肿瘤促进因子:在骨肉瘤中 与病人肿瘤大小及不良预后均呈正相关 通过与 竞争性结合从
4、而增强骨肉瘤细胞的增殖、侵袭以及上皮 间质转化()能力在宫颈癌中 通过募集 从而降低 表达最终促进肿瘤凋亡抑制此外在前列腺癌中 可通过转录激活 从而通过竞争性结合机制抑制 表达最终上调 表达从而增强癌细胞的增殖与转移 然而 是否可影响乳腺癌细胞铁死亡仍需要进一步研究 组蛋白乙酰化是基因表达过程中重要的调控机制之一乙酰化的组蛋白可吸引其他转录因子(如)的聚集并启动下游基因表达 结合蛋白 ()是已知的组蛋白乙酰基转移酶可促进组蛋白乙酰化从而调控基因表达 在 阴性乳腺癌中 高表达被认为是肿瘤复发及转移的高危因子机制层面 已被证实可促进乳腺癌细胞的 过程从而增强肿瘤转移另外 可通过结合 增强子促进后者
5、表达从而增强乳腺癌细胞的增殖 但是目前 在乳腺癌中的研究仅局限于增殖与转移其是否可调控乳腺癌细胞的铁死亡尚无报道本文通过系列实验揭示 在乳腺癌组织中的表达情况及其与生存预后的关系并探讨 抑制乳腺癌细胞铁死亡的相关机制 材料与方法.研究对象选取 年 月 年 月于我院接受手术治疗的乳腺癌患者共 例收集肿瘤组织及距肿瘤外缘 的癌旁组织 整理患者临床病理资料包括患者年龄、肿瘤大小、免疫组化类型、淋巴结转移、雌激素受体()及孕激素受体()状态纳入标准:()患者自愿参与本研究并签署知情同意书()术前未经新辅助放、化疗等干预措施()均经外科手术治疗()病理学诊断为浸润性乳腺癌 排除标准:()双侧乳腺癌()男
6、性乳腺癌()期乳腺癌()术前已接受新辅助治疗包括化疗内分泌治疗或中药治疗 本实验的组织收集已经过哈医大附属肿瘤医院伦理委员会审查().研究方法诊断标准:雌激素受体()、孕激素受体()和人类表皮生长因子()的表达水平采用免疫组化法检测分子分型参照 版 乳腺癌指南:()三阴性型:、及 均为阴性()阳性型:过表达或扩增、均为阴性 任意比例或 过表达或扩增 阳性 任何 任意比例()型:阴性或者低表达 阳性 阳性任意比例.主要试剂 培养基、培养基及 培养基购于美国 公司 购于中国 公司 兔抗人单克隆抗体、兔抗人单克隆抗体、鼠抗人单克隆抗体购于美国 公司 购于中国 公司 试剂盒购于中国 公司干扰 片段 及
7、 过表达质粒由上海吉玛公司完成引物合成由上海 公司完成.细胞培养本研究中主要培养了 与 共两种人源乳腺癌细胞系 和 细胞用含胎牛血清的 培养基在、培养箱进行培养细胞系筛选应用的 及 细胞系用含 胎牛血清的 培养基在、培养箱进行培养 及 细胞系用含 胎牛血清的 培养基在、培养箱进行培养.细胞转染细胞消化离心后加入至 孔板而后补充 实用肿瘤学杂志 年第 卷第 期总第 期细胞培养液/孔每孔加入 培养基和 转染试剂.充分混匀 再将 混合液或过表达质粒加入至 孔板细胞中待转染 后提取 后提取蛋白用于后续实验检测实验应用转染序列见表.细胞增殖实验()细胞消化后离心收集转染 后的细胞接种 孔板密度为 个/实
8、验组别分别为空载体组(组)敲降组(组、组)铁死亡抑制剂组(组)过表达组 敲降 铁死 亡 抑 制 剂 组(组、组)铁死亡促进剂组(组)敲降 铁死亡促进剂组(组、组)以及 过表达 组以上细胞均在敲降 后加入试剂二氧化碳培养 每组细胞均设置 个复孔 加入细胞悬液约 后细胞基本贴壁此时加入药物()作用 后加入 溶液细胞培养箱内继续孵育 使用酶标仪测定 吸光度 根据所测的吸光度值进行统计分析.实验 反应使用 公司的 ()试剂盒总反应体系为 使用 作为内参每个样本均设置 个孔为平行对照(表)法计算作为目的基因相对表达量 (目的基因 值 管家基因 值)实验组 (目的基因 值 管家基因 值)对照组 根据此公式
9、计算出目的基因相对对照组的表达量 共设置空载体组()组 敲降组(、组)以及 过表达组 细胞筛选实验应用 细胞系进行检测 应用 中位表达值区分高低表达量高于中位表达值定义为“高表达”低于中位表达值定义为“低表达”表 细胞转染 及过表达质粒序列 :.实验细胞消化离心后进行 裂解液处理提取蛋白而后进行浓度测定并煮沸变性处理 配制好胶后将胶板固定于相应电泳槽内加入蛋白样品恒压 进行电泳而后经过转膜()封闭 一抗经 稀释后进行过夜孵育以 为内参 次日 洗膜三次应用荧光二抗室温孵育 再次 洗膜 次应用化学发光超敏显色剂(碧云天公司碧云天公司)混合显色.铁含量测定实验细胞消化后离心弃掉上清后使用 公司生产的
10、铁含量测定试剂盒()中的缓冲液()制备成 的细胞悬液下 离心 取上清 准备好稀释样品的溶液(实验缓冲剂:还原剂:样品 )共 与等体积的工作液混合离心 取上清应用酶标仪测量 吸光度.丙二醛()含量测定实验细胞消化后离心弃掉上清后使用 含量测定试剂盒(南京建成公司 )中的 号提取液.混匀 超声破碎细胞制成悬液取样.放置于.离心管中取样.放置于.离心管中 配制上样液涡旋混匀水浴 将液体分别取 加入至 孔板中使用酶标仪测定 下各个孔的吸光度.公共数据分析 上游转录因子预测数据来源于 数据库(:/./)实用肿瘤学杂志 年第 卷第 期总第 期上游组蛋白修饰位点分析来源于 数据库(./).随访采用门诊复查和
11、电话等方式了解病人术后情况 随访开始日期为患者初次诊断为浸润性乳腺癌 随访截止日期为 年 月 研究的终点包括无病生存期()和总生存期()指从病理确诊为乳腺癌到首次观察到复发的时间 指从病理确诊为乳腺癌到随访结束或死亡的时间.统计分析实验数据分析采用 .和.软件所有实验均重复三次计量资料数据以均数 标准差表示 相分析配对资料使用配对 检验两组间比较采用 检验三组及以上比较使用方差分析 应用 线性相关分析 与 以及 与 的相关性 生存资料的分析使用 方法和 检验.为差异具有统计学意义 结果.在乳腺癌中的表达情况及与生存预后的关系 提示 在肿瘤组织的表达高于癌旁组织(.)(图)在侵袭转移能力最强的
12、型乳腺癌中表达高 于 型 及 型(图 .)故后续实验我们选择 型乳腺癌细胞系进行相关实验 随后我们选取()乳腺癌样本 例并随机抽取剩余 例()乳腺癌样本中的 例进行分析发现 在预后较差的()乳腺癌中表达高于()者(图 .)高表达与乳腺癌病人的 及 短相关(图 .)且 表达与肿瘤大小有关(.)与肿瘤转移无关(表)以上结果说明 可能作为癌基因促进乳腺癌的发生发展.低表达对乳腺癌细胞铁死亡的诱导作用细胞筛选实验发现 在 细胞系中表达最高(.)在 细胞系表达最低(.)故后续实验应用 细胞系进行 敲降实验应用 细胞系进行 过表达实验(图 .)构建 敲降/过表达细胞系(见材料与方法.)后(图 .)我们发现
13、 低表达可导致细胞活力降低(图 .)过表达 组细胞活力增强(图 .)应用铁死亡抑制剂 ()后我们发现 低表达介导的细胞活力下降可被 所逆转(图 .)随后我们对敲降/过表达 后的细胞内铁含量及 水平进行了检测(水平应用脂质过氧化产物 水平检测)结果表明敲降 后细胞内 及铁含量均上调(图.)而过表达 后细胞内 及铁含量均下调(图 .)以上研究表明 与乳腺癌细胞铁死亡负相关表 引物序列 :.低表达与铁死亡促进剂的乳腺癌细胞的协同杀伤作用我们首先检测了 与 的关系通过对本单位生物样本库乳腺癌样本()进行分析发现 与 表达正相关(图 表 .)故我们应用 与 敲降联合处理乳腺癌细胞研究表明 联合 敲降可协
14、同杀伤乳腺癌细胞其效果优于单药作用(图 .)进一步研究表明联合用药后细胞内 水平及铁含量均得到协同性增强(图.)而过表达 后 的杀伤作用降低(图 .)及铁含量亦被逆转(图 .)这说明抑制 联合铁死亡促进剂可作为治疗乳腺癌的手段.抑制乳腺癌细胞铁死亡的作用机制构建 敲降的乳腺癌细胞系后对 表达进行了检测发现 敲降后 表达下调(图 .)因此 对铁死亡的抑制作用可能通过调控 表达实现 数实用肿瘤学杂志 年第 卷第 期总第 期据库分析得知组蛋白乙酰化转移酶 可能作为转录因子上调 表达(表)这一点我们也通过分析 数据库得到证实(图)上游确实存在 结合位点且生物样本库分析表明 与 表达正相关(图.)随后我
15、们进行 实验发现敲降(图 .)后 表达下调(图 .)蛋白印迹结果表明敲降 后 表达下调(图 .)因此推测 作为转录因子上调 表达后者通过上调 表达抑制乳腺癌细胞铁死亡图 乳腺癌患者 表达与病人生存预后的关系 :.表 数据库预测 上游调控因子 ()./.实用肿瘤学杂志 年第 卷第 期总第 期图 对乳腺癌细胞铁死亡的抑制作用 :.实用肿瘤学杂志 年第 卷第 期总第 期图 敲降 联合铁死亡促进剂乳腺癌细胞的协同杀伤作用 :.图 通过 轴抑制乳腺癌细胞铁死亡 :.实用肿瘤学杂志 年第 卷第 期总第 期表 乳腺癌患者 表达情况与临床病理特征的关系()()()()().()()()()()().()()(
16、)()()().()()()()()().()()()().()()().()()()()()()()()()讨论乳腺癌是全球女性最易罹患的恶性肿瘤其病程中出现的多器官转移是导致病人死亡的主要原因 乳腺癌的发生发展是诸多因素相互作用、相互制约、相互影响下的极其复杂的病理过程故乳腺癌的发病机制需从多层面多角度进行解析 虽然在临床工作中可采用手术、化疗、放疗、内分泌治疗以及靶向治疗等多种方法治疗乳腺癌仍有部分病人因乳腺癌死亡 铁死亡已被证实可杀伤乳腺癌细胞但其内在机制仍需要进一步研究包括铁死亡在乳腺癌中的调控靶点以及铁死亡促进剂对乳腺癌细胞的杀伤能力等 与肿瘤发生发展的多个阶段具有密切联系其扮演的角色涉及多个生物学过程及分子信号通路 然而 在铁死亡中的作用仍需要进一步挖掘 目前研究表明 通过下调其反义基因 从而降低过氧化物酶 的表达增强肝癌细胞内脂质过氧化并引发铁死亡靶向 可有效杀伤肝癌细胞而对临近正常肝细胞无明显影响此外胶质瘤细胞可通过上调 表达抑制肿瘤细胞铁死亡 随着铁死亡相关分子生物学技术的发展部分研究已发现 对铁死亡的调控靶点 可通过竞争性结合 从而下调抗氧化因子 表达增强铁死亡促
