1、基金项目：山西省重点研发计划项目（）作者简介：杨坤，男，生，硕士，：收稿日期：增强自噬拮抗抵抗素诱导的心肌细胞肥大杨坤，邓勇志（山西医科大学附属心血管病医院，山西省心血管病医院，山西省心血管病临床医学研究中心心脏大血管外科，太原 ；通讯作者，：）摘要：目的从细胞层面探究 拮抗抵抗素诱导心肌肥大的分子机制。方法将 大鼠心肌细胞株分为 组：对照组、抵抗素组、组、抵抗素组。细胞饥饿 后进行干预，对照组转染空载体 （）；组转染 ；抵抗素组转染 ，后更换为完全培养基且加入抵抗素继续处理 ；抵抗素组转染空载体 （），后更换为完全培养基且加入抵抗素继续处理 。干预 后收集细胞，使用 法测单细胞蛋白含量；检测
2、心肌肥大相关胚胎基因 、的相对表达量；检测通路蛋白 、及自噬相关蛋白 、表达量。结果与对照组相比，抵抗素组细胞内的蛋白含量增加（），和 的表达量上调（或 ），表达量下降（），的表达量上调（），和 的表达量降低（或 ）；与抵抗素组相比，抵抗素组细胞内蛋白含量降低（），和 的表达量下调（），表达量升高（），的表达量降低（），和 的表达量升高（）。结论 通过 信号通路增强自噬拮抗抵抗素诱导的心肌细胞肥大。关键词：；心肌肥厚；自噬；抵抗素中图分类号：文献标志码：文章编号：（）：，（，；，：）：，（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（）：；心力衰竭是多种心血管疾病的终末期表
3、现，致死率居高不下 。心肌肥厚是心力衰竭的病理生理基础，其特征性改变为心肌细胞蛋白质合成增加、能量代谢异常以及胚胎基因重新激活等 。尽管近几十年对于心力衰竭机制的认识和预防措施已取得了长足的进步，仍有 的患者进展到疾病山西医科大学学报，年 月，第 卷 第 期晚期阶段 。因此，进一步阐明心力衰竭心肌肥厚的分子学机制至关重要。是真核细胞中能量代谢的主要信号通路，由细胞内 进行调控 。研究发现，胰高血糖素样肽 激活剂 能够通过 信号通路对肥厚心肌具有保护作用，但当加入 抑制剂化合物 时会抵消该作用 。另有研究显示肌肉生长抑素（，）通过阻断 通路可以抑制心肌过度自噬，发挥心肌保护作用 。通过对 型糖尿
4、病患者肥厚心肌检测发现，其自噬相关蛋白含量明显降低 ，这些研究表明 信号通路以及自噬与心肌肥厚的发生和发展密切相关。近年来有研究发现长链非编码 （，）参与病理性心肌肥厚的发生，例如心肌梗死相关转录本（，）、心脏肥大相关调 节 本（，）等。同源盒转录本反义 （，）是一种重要的表观遗传调节因子，长度为 个核苷酸，以往对其研究主要集中在癌症领域 ，研究发现其在髓核细胞中通过增强自噬促进细胞的衰老和凋亡，加重椎间盘退行性变 。而 在心肌细胞中的作用尚未有报道，考虑到自噬作用与心肌肥厚密切相关。我们提出假设：能够增强心肌细胞自噬作用，进而拮抗心肌细胞肥大。为验证该假设，本研究将通过调控 表达量，检测心肌
5、细胞肥大的相关指标，探讨 对心肌细胞肥大的影响及可能的分子机制。材料与方法 细胞与质粒实验细胞为大鼠 心肌细胞，购买于 细胞库。含有 的质粒及对照组质粒采购于中国南京晶麦生物科技公司质粒与蛋白共享库（，）。细胞培养及干预使用含 胎牛血清、高糖 培养基于、含 培养箱中培养 细胞，更换一次培养液，待其生长至 瓶底面积 左右时进行传代及铺板。实验分为 组：对照组、组、抵抗素组、抵抗素组，细胞饥饿 后进行干预，对照组转染空载体 （），后更换为完全培养基继续培养 ；组转染 ，后更换为完全培养基继续培养 ；抵抗素组转染 ，后更换为完全培养基且加入抵抗素（，）继续处理 ；抵抗素组转染空载体 （），后更换为完
6、全培养基且加入抵抗素继续处理 。细胞转染按照转染载体 说明书配制体系，取两支 管，分别加入 溶液，其中一支加入 溶液（），另一支加入 溶液，静置 ，将其混匀，再静置 。得到约 转染试剂。孔板中每孔加入 试剂，置于 、细胞培养箱中培养 后，更换为不含转染试剂的培养液，对照组和抵抗素组使用相同方法转染对照质粒 （）。后转染结束，通过 检测 表达量以判断转染效率。实时定量逆转录 检测胚胎相关基因以 为内参，使用 检测不同干预组胚胎相关基因 、的相对表达量。胚胎相关基因引物由 公司设计，序列如下：上游引物：，下游 引 物：；上游引物：，下游引物：；上游引物：，下游引物：。细胞干预 后，使用 试剂盒进行
7、 提取，再使用 （）试剂盒进行逆转录，最后根据 试剂盒说明书配制体系，使用罗氏荧光定量 仪进行检测。结果计算：样品目的基因相对表达量 ；同组待测基因 值 同组内参（）值；干预组 值 对照组 值。蛋白质印迹法（）检测自噬及相关通路蛋白相对表达量细胞干预 后，使用增强型 裂解液（武 ，汉博士德）裂解细胞，使用 蛋白浓度测定试剂盒（武汉博士德）绘制蛋白浓度曲线并测定样品浓度。依据分子量大小采用合适比例的 分离胶进行电泳。然后转至 的 膜上，先后予以 脱脂牛奶封闭 、孵育一抗 （）、，稀释比例 过夜、孵育二抗（，）处理。再使用超敏 化学发光即用型底物（武汉博士德）试剂盒进行曝光。以 为内参，检测通路蛋
8、白 、，以及自噬相关蛋白 、的表达量。法测单细胞蛋白含量使用血细胞计数板计算 孔板中细胞量，裂解细胞提取蛋白后，使用酶标仪测定 处吸光度（值）计算蛋白浓度。最后估算单细胞蛋白含量。统计学方法本实验重复 次，实验数据采用均数 标准差（珋 ）表示，使用 进行统计学分析。多组间采用单因素方差分析或 检验，多组间两两比较采用最小显著差异法（）。为差异具有统计学意义。结果 转染效率转染处理 后，使用试剂盒提取 ，检测对照组与 组 表达情况，进行次生物学重复，结果发现，对照组无扩增曲线，组扩增曲线正常（见图 ），提示转染成功。绿色为 组，黄色为对照组图 检测 转染效率曲线 降低抵抗素处理的 细胞蛋白含量细
9、胞干预 后，使用 法计算各组单细胞蛋白含量。与对照组相比，抵抗素组单细胞蛋白含量升高（）；与抵抗素组相比，抵抗素组单细胞蛋白含量下降（，见图 ）。降低抵抗素处理的 细胞的胚胎基因表达量与对照组相比，抵抗素组 、表达量显著上调（或 ）；与抵抗素组相比，转染 抵抗素组 、表达量下降（，见图 ）。减轻抵抗素对 细胞 信号通路的抑制作用与对照组相比，抵抗素组 的表达量下与对照组相比，；与抵抗素组相比，图 抵抗素及 对单细胞蛋白表达量的影响 山西医科大学学报，年 月，第 卷 第 期与对照组相比，；与抵抗素组相比，图 检测各干预组 及 相对表达量 调（），其下游蛋白 的表达量升高（）；与抵抗素组相比，抵抗
10、素组 的表达量上调（），表达量降低（）；与对照组相比，组 的表达上调（，见图 ）。提示 对能量代谢异常所致的心肌肥厚有保护作用。与对照组相比，；与抵抗素组比，图 检测各干预组 与 的相对表达量 增强抵抗素处理的 细胞自噬作用与对照组相比，抵抗素组 表达、的表达降低（或 ）；与抵抗素组比较，抵抗素组 、表达量上调（，见图 ）。讨论近几年由于高通量测序及基因芯片技术的发展，从不同人体组织中发现的 增加到了 万多种，对 的研究也从癌症领域逐渐扩大到其他疾病领域。同时，越来越多的研究发现 广泛参与到各类心血管疾病的发病过程中，尤其与心肌细胞肥大的发生密切相关，等 检测了急性心梗病人及小鼠模型的血清，发
11、现 的表达显著降低，为临床急性心梗的诊治及预后提供了新的研究方向。等 发现，通过抑制 表达，进而增强 小鼠心肌细胞的细胞活力、减轻 介导的氧化应激损伤，发挥心肌保护作用。在慢性心力衰竭（，）的小鼠心肌细胞模型中，的表 ，与对照组比较，；与抵抗素组相比，图 检测自噬相关蛋白的相对表达量 达也呈下降趋势，通过 轴可以减轻心肌细胞的功能损伤、氧化应激反应以及细胞凋亡 。此外，还可以通过激活磷脂酰肌醇 激酶 蛋白激酶 通路来增强人心肌细胞的活力，从而改善糖尿病心肌病 。这些研究证明了 对多种原因诱导的心血管疾病有保护作用。另外，大量研究发现自噬与心肌细胞肥大密不可分。自噬是一种高度保守的分解代谢过程，
12、由溶酶体清除受损细胞器和蛋白聚集物，并将其产物循环利用来维持细胞内稳态 。一方面，自噬可视为保护反应，基础自噬通过降解和循环利用损伤细胞器和蛋白，促进细胞的存活；另一方面，在应激条件下，过度自噬导致细胞器和蛋白过度降解，从而触发细胞死亡 ，其上游通路蛋白 作为细胞能量的主要传感器，参与细胞生长、细胞周期、细胞存活等多种细胞过程 。当细胞内 下调时，细胞中的肿瘤抑制因子 以及钙敏感性激酶 就被激活，进一步激活 后，细胞内的糖酵解增强，糖原的合成减弱，以此提高细胞内 的含量；与之相反，能够在细胞高营养状态下促进蛋白质的合成，增加能量的消耗，并且其复合体 能够磷酸化 并抑制其活性，进而减弱自噬 。使
13、用抵抗素诱导心肌细胞肥大伴随着能量代谢异常，是否通过此通路发挥作用呢？考虑到 的重要性，本实验研究了其对心肌细胞肥大的影响。干预 后，细胞的蛋白含量以及胚胎基因 、的表达明显升高，说明成功诱导了心肌细胞肥大。随后我们将 转染进细胞中，发现 组单细胞蛋白含量及 、相对表达量较抵抗素组明显下降。表明 对心肌细胞肥大有一定保护作用。这与 等 的研究结果一致。通过进一步检测，我们还发现 抵抗素组 的表达较抵抗素组明显升高，的表达明显降低。提示 可能激活 通路发挥作用。并且与抵抗素组相比，抵抗素组 、的表达量显著上调，表明 增强了抵抗素诱导的肥大心肌细胞的自噬作用。此外，我们发现了一个问题，正常心肌细胞
14、转染 后 的表达明显上调。我们猜测可能与 通路能够整合来自生长因子、环境应激、能量、氧化和氨基酸 个方面对细胞的刺激信号来调控蛋白和脂肪合成及自噬等许多重要生理过程有关 ，也能够与多种 相互作用，并且对 通路 、损伤 等多个方面发挥作用，上调是综合作用的结果，具体机制仍需研究。本实验仍存在部分缺陷，进行单个细胞蛋白含量测定时，实验人员镜下进行细胞计数时主观因素较强，该项指标数据不够准确，考虑到心肌细胞肥大的另一表现为细胞表面积增大，可以通过细胞涂片进而使用 软件进行测定，观测各组心肌细胞表面积变化。实验仅为细胞水平研究，仍需动物实验进行验证。综上，我们得出以下结论：通过 山西医科大学学报，年 月，第 卷 第 期 信号通路增强自噬拮抗抵抗素诱导的心肌细胞肥大。能够成为预防心肌肥厚的新的研究方向。参考文献：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，：，：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，：，（），：，
