1、 山 东 农 业 科 学():./.收稿日期:基金项目:山东省高校中药质量控制与全产业链建设协同创新中心项目()山东省创新公共服务平台计划中药分子鉴定公共服务平台项目()山东省农业科学院齐鲁农科英才工程(创新类)项目作者简介:朱桐杉()女山东临沂人硕士研究生研究方向:中药资源与质量控制研究:.通信作者:张永清()男山东平邑人教授主要从事中药资源与质量控制研究:.张全芳()女甘肃酒泉人副研究员主要从事中药资源开发与利用:.种常见金银花致病菌多重实时荧光定量 检测方法研究朱桐杉刘艳艳谭晴晴刘国霞陈雪燕步迅王文博于子涵张全芳张永清(.山东中医药大学药学院山东 济南.山东省农业科学院农作物种质资源研究
2、所山东 济南.山东省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所山东 济南.山东中医药大学附属医院山东 济南)摘要:为了建立可同时检测炭疽病病原菌()、白粉病病原菌()和褐斑病病原菌()种金银花重要叶部病原菌的多重实时荧光定量 快速检测方法本试验基于 种病原菌 片段序列分别设计特异引物和 荧光探针并制备重组质粒建立标准曲线对建立的多重实时荧光定量 检测方法进行特异性、灵敏度、准确性验证 结果表明本研究建立的多重实时荧光定量 快速检测方法仅针对金银花炭疽病、白粉病和褐斑病病原菌有特异性扩增最低检测限为./比普通 法高 倍利用本方法检测 份有叶部病害症状的金银花病叶与 测序结果完全一致 综之本研究建立的
3、多重实时荧光 检测方法特异性强、灵敏度高为金银花炭疽病、白粉病和褐斑病的早期诊断提供了技术支持关键词:金银花炭疽病白粉病褐斑病多重实时荧光定量 中图分类号:.文献标识号:文章编号:()(.)()()()./.金银花又名忍冬花是忍冬科植物忍冬(.)的干燥花蕾或带初开的花在我国分布广泛 主要有效成分为黄酮类、环烯醚萜类、挥发油类、酚酸类等其在医药领域中的应用非常广泛具有清热解毒、通经活络、消炎消肿之功效随着金银花种植年限的增长病虫害也逐渐加重以叶部病害和根部病害为主 其中炭疽病、褐斑病和白粉病是最常发生的叶部病害褐斑病可导致叶片枯萎脱落金银花植株感染白粉病会导致花蕾发育畸形严重时会大量落花炭疽病侵
4、染茎枝时会使枝条倒伏、枯死影响植株生长发育降低花蕾的产量与品质 目前对于金银花病害的检测手段较少 传统的病原菌鉴定方法通常为病原菌分离后经过柯赫氏法则结合分子生物学进行鉴定该过程耗时长容易延误病害防治时机 做好金银花病害的早期检测、及时开展防治工作有效降低化学农药施用量对于保证金银花药材产量和质量具有重要意义 因此建立一种快速、准确检测金银花炭疽病、褐斑病及白粉病病原菌的方法并应用于 种病害的早期防治是当务之急前期在山东省临沂市平邑县金银花主产区发现并分离出炭疽病病原菌胶胞杆菌()并验证了病原菌的致病性结合已报道的金银花主要叶部病害褐斑病病原菌鼠李尾孢()和白粉病病原菌()基于 序列分别设计了
5、特异引物和 探针通过优化 体系和反应条件建立了多重实时荧光 检测体系实现了金银花炭疽病、褐斑病和白粉病病原菌的快速、准确和高通量检测以期为及时有效地防治金银花叶部病害提供技术支持 材料与方法.材料与试剂白粉病病原菌()、炭疽病病原菌胶孢炭疽菌()、褐斑病病原菌鼠李尾孢()、白绢病病原菌()、黑曲霉()、禾谷镰刀菌()、金银花叶斑病病原菌(.)、木霉菌(.)保存于山东省农业科学院农作物种质资源研究所用于验证试验的金银花病害样本采集于山东中医药大学药用植物园和山东省临沂市平邑县金银花产区高效植物基因组 提取试剂盒天根生化科技(北京)有限公司 分子量 天根生化科技(北京)有限公司真菌基因组 提取试剂
6、盒()电泳上样缓冲液宝生物工程(大连)有限公司.仪器与设备 荧光定量 仪(美国)仪宝生物工程(大连)有限公司 超微量核酸检测仪(赛默飞世尔)型高速离心机(公司)凝胶成像仪(公司)紫外可见分光光度计(日本岛津公司)引物和探针序列由上海捷瑞生物工程有限公司合成 使用 软件进行绘图 使用 软件进行表格制作 山 东 农 业 科 学 第 卷.试验方法.种病原菌特异引物及 探针设计 根据 上的鼠李尾孢菌(登录号.)、胶孢炭疽菌(登 录 号.)及白粉病病原菌(登录号.)序列使用 .软件分别设计引物对和 探针引物及探针序列见表 表 引物和探针序列菌株引物、探针名称引物、探针序列()目的片段长度()胶孢炭疽菌白
7、粉病病原菌鼠李尾孢菌 注:探针中、及 为 种不同荧光染料 为荧光淬灭基团.多重实时荧光 体系构建多重实时荧光 反应体系():炭疽病病原菌上、下游引物和探针各 白粉病病原菌上、下游引物和探针各 褐斑病病原菌上、下游引物和探针各 模板 褐斑病引物和探针的终浓度分别为./和./白粉病引物和探针的终浓度为./和./炭疽病病原菌引物和探针的终浓度为./和./多重实时荧光 扩增条件:(在此阶段收集荧光信号)个循环.重组质粒的构建 使用.中金银花褐斑病、白粉病及炭疽病病原菌特异引物进行基因扩增参考李敏的方法进行重组质粒构建对重组质粒 产物进行测序验证是否正确插入目的片段 测序在山东省农业科学院农作物种质资源
8、研究所进行.实时荧光 标准曲线建立 使用 紫外分光光度计测定 种病原菌阳性重组质粒 浓度将重组质粒 定量至./按照 倍梯度稀释成 个浓度每个梯度 次重复 反应体系与程序按照.进行根据重组质粒拷贝数初始量值和阈值循环数()进行多重实时荧光 体系标准曲线的构建.引物和探针特异性检测分别以胶孢炭疽菌、鼠李尾孢菌、白粉病病原菌、白绢病病原菌、木霉菌、禾谷镰刀菌、金银花叶斑病病原菌、黑曲霉的基因组 为模板按.中多重实时荧光 反应条件及反应体系进行检测每个样本 次重复验证引物和探针的特异性.多重实时荧光 方法灵敏度验证将重组质粒 定量至./按照 倍梯度依次稀释 个浓度每个浓度重复 次根据荧光信号值大小评价
9、相应引物和探针对 种病原菌的检测灵敏度 同时以此 模板和表 中特异引物进行普通 扩增每个浓度重复 次普通 扩增体系:.、(./).、酶().、上下游引物(/)各.、模板(/).扩增程序:个循环.验证试验利用本研究建立的 种病原菌多重实时荧光 检测方法对从临沂市平邑县金银花产区、山东中医药大学药用植物园采集的 份叶部病害样本进行检测同时提取样本、使用真菌通用引物:进行 扩增切胶回收并测序 将两种检测方法的结果进行比较以验证本研究所建立的多重实时荧光 方法的准确性与可行性 结果与分析.实时荧光 标准曲线建立以重组质粒拷贝数初始量值为横坐标 值为纵坐标 得到褐斑病线性回归方程为 .白粉病线性回归方程
10、为.炭疽病线性回 第 期 朱桐杉等:种常见金银花致病菌多重实时荧光定量 检测方法研究归方程为 .(图)种病原菌实时荧光 标准曲线相关系数均大于.扩增效率均接近 标准曲线横纵坐标间形成良好线性关系表明该方法具有效性:褐斑病病原菌标准曲线图:白粉病病原菌标准曲线图:炭疽病病原菌标准曲线图图 种病原菌实时荧光 标准曲线图.引物和探针特异性验证按照.方法进行特异性验证当 荧光修饰探针有扩增曲线且满足 时说明待检样本检出炭疽病病原菌当 荧光修饰探针有扩增曲线且满足 时说明待检样本检出白粉病病原菌当 荧光修饰探针有扩增曲线且满足 时说明待检样本检出褐斑病病原菌当、和 荧光修饰探针均无扩增曲线时表明该检测样
11、品为阴性 由表 可知本试验建立的多重实时荧光定量 方法只能特异扩增目的病原菌对其他病原菌均无扩增说明本研究建立的多重实时荧光定量 体系的引物及探针的特异性良好 表 引物及探针特异性验证试验病原名称炭疽病病原探针()值白粉病病原探针()值褐斑病病原探针()值结果判定炭疽病病原菌.炭疽病病原菌阳性白绢病病原菌褐斑病病原菌.褐斑病病原菌阳性木霉菌禾谷镰刀菌金银花叶斑病病原菌白粉病病原菌.白粉病病原菌阳性黑曲霉 注:“”表示阴性.检测灵敏度多重实时荧光定量 检测方法和普通 法对金银花褐斑病、白粉病和炭疽病 种病原菌灵敏度验证结果见图、组重组质粒在浓度./时 值因此多重实时荧光定量 法对 种病原菌检测最
12、低检 山 东 农 业 科 学 第 卷测限为./在普通 扩增中当模板 浓度为./时有明显扩增条带低于此浓度则无扩增条带因此普通 法 检 测 灵 敏 度 为./(图)结果表明本试验建立的多重实时荧光 检测方法的灵敏度比普通 法高 倍.验证试验分别使用本试验建立的检测方法和 测序法对实际样本进行检测多重实时荧光定量 结果检测出炭疽病病原菌阳性样本 份、白粉病阳性样本 份、褐斑病阳性样本 份检出率为 与 测序结果完全一致(表)表 实际样本检测结果样品编号 测序结果中文名称多重实时荧光 结果 胶孢炭疽菌炭疽病病原菌阳性 胶孢炭疽菌炭疽病病原菌阳性 胶孢炭疽菌炭疽病病原菌阳性 胶孢炭疽菌炭疽病病原菌阳性
13、白粉病病原菌白粉病病原菌阳性 白粉病病原菌白粉病病原菌阳性 鼠李尾孢褐斑病病原菌阳性 白粉病病原菌白粉病病原菌阳性 鼠李尾孢褐斑病病原菌阳性 鼠李尾孢褐斑病病原菌阳性 鼠李尾孢褐斑病病原菌阳性 白粉病病原菌白粉病病原菌阳性 白粉病病原菌白粉病病原菌阳性 鼠李尾孢褐斑病病原菌阳性 鼠李尾孢褐斑病病原菌阳性 第 期 朱桐杉等:种常见金银花致病菌多重实时荧光定量 检测方法研究、分别为褐斑病、白粉病、炭疽病灵敏度检测图图、中 质粒浓度分别为.、.、.、.、.、.、.、./图 中孔 所用质粒浓度分别为.、.、.、.、.、./为阴性对照 为 图 种病原菌多重实时荧光定量(、)和常规()扩增体系灵敏度 讨论
14、与结论金银花为山东道地药材之首主产于山东省临沂市平邑县 以花入药药用历史悠久 性味甘寒气味芳香有清透疏表、清热解毒之效 亦可食用具有一定的保健功能老少皆宜传统植物病原菌通常使用组织分离法结合 测序法进行鉴定如紫薯腐败菌的分离和鉴定、马铃薯赤霉病病原菌的分离和鉴定等耗费时间较长 实时荧光定量 法可实现数个样品的自动化检测成本低较普通 技术所用时间短能在病害初期进行快速检测 目前已经建立了柑橘枯萎病病毒、橄榄果实中敏感炭疽菌等实时荧光定量 检测方法褐斑病、白粉病及炭疽病是常见的 种金银花叶部病害也是导致金银花减产、降质的重要原因 感染白粉病时叶部绿原酸含量降低褐斑病、炭疽病发病后期斑点融合导致叶片
15、呈现圆形或不规则病斑严重时会导致全株叶片脱落、植株枯死且病害后期致病菌可停留在土壤及病残体中越冬 李志红等对封丘金银花炭疽病染病植株叶片进行分离和检测得到炭疽病病原 菌 为 胶 孢 炭 疽 菌()研究表明金银花褐斑病病原菌为半知菌亚门鼠李尾孢()、金银花白粉病病原菌为 目前对 种金银花病害的研究还停留在发病症状调查和病原菌分离鉴定阶段防治措施是在叶部出现明显症状后进行喷洒农药或剪去带病枝条而针对 种病害的分子检测方法还未见报道 实时荧光定量 技术具有操作简便、快速高效、高通量、高敏感性等特点在分子诊断、动植物检疫以及食品安全检测等方面有广泛应用提高了检测时效性和灵敏度 多重实时荧光定量 方法可
16、在同一个检测体系中对多个目标序列同时进行检测且能精确定量 如利用实时荧光逆转录定量 技术快速检测香蕉的枯萎芽孢杆菌、菊花的花叶白锈菌及褐锈菌、马铃薯中常见疮痂病及病原菌以及检测羊奶中牛奶和大豆源性成分本研究基于 序列设计引物与 探针建立了可同时检测金银花褐斑病、白粉病及炭 山 东 农 业 科 学 第 卷疽病 种病害病原菌的多重实时荧光 检测体系该方法最低检测限度为./比普通 方法提高 倍特异性强可为金银花叶部病害早诊断、早防治提供技术支持弥补了金银花炭疽病、褐斑病及白粉病病害检测方法的缺失 但本试验未曾对多种病害同时检测进行实际样本验证对于病原菌的鉴定停留在定性层面而未进行定量计算因此关于多种病原菌的同时检测及其定量分析是下一步研究重点参 考 文 献:国家药典委员会.中华人民共和国药典.北京:中药医药科技出版社.:.():.:.:.:.:.熊乐文 金莹 黄玮慕 等.金银花色泽与酚酸类成分含量相关性研究.中成药 ():.杨帆 刘玉霞 李炯 等.忍冬枝枯病对忍冬药材产量和质量的影响.中国实验方剂学杂志():.():.朱桐杉谭晴晴刘国霞等.金银花炭疽病病原菌的分离鉴定和 检测.中药材():.
