1、东南园艺 2023,11(1)：11-17Southeast HorticultureDOI：10.20023/j.c n k i.2095-5774.2023.01.00364个蓝莓品种的ISSR分析张立杰J谢丽雪J张小艳1,李韬，黄立新$C福建省农业科学院果树研究所，福建福州350013;2邵武市农业农村局，福建南平354000）摘 要：为明确不同蓝莓品种间的遗传关系，利用ISSR标记对64个蓝莓品种进行DNA指纹分析，构建 蓝莓品种的指纹图谱数据库。从60条ISSR引物中筛选出9条重复性稳定的多态性引物，共扩增出条带 161条，其中多态性条带159条，平均多态百分率达98.8%,引物UB
2、C841可将64个蓝莓品种区分开。利用扩增结果进行聚类分析，在相似系数0.568的水平可将试材分为3个类群，并对其遗传关系进行探讨。关键词：蓝莓；品种；ISSR;指纹图谱；遗传关系中图分类号：S682.31 文献标识码：A 文章编号：2095-5774(2023)01-0011-07ISSR Analysis of 64 Blueberry CultivarsZh an g Li ji e1,Xi e Li xue1,Zh an g Xi ao yan1,Li Tao1*,Huan g Li xi n2(Frui t Researc h In sti tute,Fuji an Ac ademy
3、 o f Agri c ul tural Sc i en c es,Fuzh o u,Fuji an 350013,Ch i n a;2 Sh ao wu Mun i c i pal Bureau o f Agri c ul ture an d Rural Affai rs,Nan pi n g,Fuji an 354000,Ch i n a)Abstract:In o rder to c l ari fy gen eti c rel ati o n sh i p o f di fferen t c ul ti vars o f bl ueberry,th e i n ter-si mpl e
4、 sequen c e repeat(ISSR)meth o d was appl i ed to an al yze th e DNA fi n gerpri n ti n g o f 64 bl ueberry c ul ti vars,an d a fi n gerpri n ts database was c o n struc ted.Ni n e ISSR pri mers,wi th h i gh po l ymo rph i sms an d go o d repeatabi l i ty,were sel ec ted fro m 60 ISSR pri mers.To ta
5、l 161 DNA ban ds were ampl i fi ed,159 o f wh i c h were po l ymo rph i c,th e average po l ymo rph i sm perc en tage was 98.8%.Th ese vari eti es c o ul d be sati sfac to ri l y di sti n gui sh ed by a si n gl e ISSR pri mer UBC841.UPGMA al go ri th m sh o wed th at 64 c ul ti vars c o ul d be c l
6、ustered i n to 3 gro ups usi n g a gen eti c si mi l ari ty c o effi c i en t th resh o l d o f 0.568,an d th ei r gen eti c rel ati o n sh i ps was eval uated.Key words:Bl ueberry;Cul ti vars;ISSR;DNA fi n gerpri n ti n g;Gen eti c rel ati o n sh i ps蓝莓，又名越橘、蓝浆果，为杜鹃花科(Eri c ac eae)越橘属(Vaccinium Vac
7、cinium)植物。蓝莓被喻为世界第三代水果，可果实鲜食、加工或作为 高级化妆品原料。蓝莓因其集约化、精细化栽培、收稿日期：2022-12-01基金项目：福建省属公益类科研院所基本科研专项（2020R10280011,2019R1028-1）作者简介：*为通讯作者，李韬（1969-）,男，副研究员，主要从事小浆果种质资源与栽培育种研究，E-mai l：Leetao 06163.c o m。张立杰（1981-）,男，助理研究员，硕士，主要从事小浆果选育种与栽培技术研究，E-mai l：zh an gl i ji eOl 1 l 163.c o m12东南园艺第11卷符合现代果业要求且价格优势明显
8、，成为中国新 兴果业的代表，各个省份都在大力发展。福建省属亚热带季风气候，土壤多为酸性的 红壤、黄壤且有机质含量高，适合南高丛和兔眼 蓝莓的生长。福建为蓝莓发展新区，早期种植多以 民间引种试种为主，规模小，多点开花。据不完全 统计，2016年，福建省蓝莓栽培面积约800 h n?,投产不足300 h m2,主要分布在龙岩、宁德、福州 等地。栽培品种多样，包括奥尼尔夏普蓝密 斯提，莱格西威尔，海岸，顶峰，灿 烂园蓝粉蓝精华杰兔乌达德 等。随着产业的发展和种植面积的增加，蓝莓品 种和苗木市场混杂的问题日益突出，部分北高丛 蓝莓品种如杜克南丰等也被引入，给相 关蓝莓种植户造成极大损失。为此，开展蓝莓
9、品 种的鉴定评价成为福建蓝莓产业发展的迫切问题。由DNA分子标记衍生的DNA指纹技术在 鉴定品种真实性和纯度等方面是很有效的，其中 ISSR标记是一种简单序列重复区间扩增多态性分 子标记，目前已广泛应用于植物品种鉴定、遗 传图谱构建及遗传多样性研究等。该技术 已运用于构建苹果、杏、柑橘、枇杷、龙眼、火龙果、獄猴桃等果树的指纹图谱。本研究应用ISSR分子标记对64个蓝莓品种的遗 传关系进行分析，建立DNA指纹图谱，为蓝莓品 种调査、鉴别及蓝莓产业合理布局服务。1材料与方法1.1试验材料选取64个蓝莓品种（表1）,其中南高丛品 种12个，北高丛品种34个，半高丛品种3个，兔眼品种11个，矮丛3个品
10、种来自浙江蓝美农业 有限公司，取其嫩叶作为研究试材。1.2蓝莓叶片DNA提取采用TIANGEN植物基因组DNA提取试剂盒 进行蓝莓叶片DNA提取，采用琼脂糖凝胶电泳和 紫外分光光度计测定DNA的质量和浓度。最终将 DNA稀释至25 n g 応，置于-20 CC冰箱备用。1.3蓝莓ISSR反应体系的建立ISSR-PCR反应体系由2.0応DNA模板、2.5|xL 10 x Ex Taq Buffer、2.5|1L dNTP、2.0|jlL 10|i mo l L1 引物、2.0|xL 25 mmo l L_1 MgCl2 0.3|1L 5 U|L _1 Taq DNA po l ymerae 和
11、13.7|jlL ddH2O 组 成，总体积为25応。ISSR引物序列参考加拿大哥 伦比亚大学 UBC Pri mer Set#9（Un i versi ty o f Bri ti sh Co l umbi a Bi o tec h n o l o gy,UBC）,）,委托生工生物工 程（上海）股份有限公司合成。反应程序：94七预变性5 mi n,94七变性 45s,55七退火45s,72七延伸90s,重复35个循 环；最后在72七延伸10 mi n;4七保存。PCR反应 在Tec h n e PCR仪上进行。电泳检测采用6%变性 聚丙烯酰胺凝胶，电泳缓冲液为1 xTBE,150V电 压电泳4
12、h,电泳结束后银染拍照。1.4 ISSR引物的筛选及扩增产物多态性的统计分析用60条随机引物对任意一份DNA样品在上述 的反应体系及扩增程序中进行扩增，以筛选引物，引物需符合如下条件：条带清晰、空白中无或少假 带、对所有样品均有质量好的条带。根据电泳图谱 进行读带，电泳图谱中的每一条带记为一个分子标 记。以清晰及能重复的条带记为“1”其余的为“0”,娠处理完后运用NTSYS-PC 2.0软件进行聚类分析。2结果与分析2.1多态性ISSR引物的筛选选择适宜的引物是构建DNA指纹图谱的关键 因素之一。本研究从60条随机引物中筛选出9条 带型好、多态性高、重复性好的引物。9条ISSR引 物对64个品
13、种的扩增结果见表2,共扩增出条带 161条，其中多态性条带159条，平均多态百分率 达98.8%o各引物扩增的条带数在525条之间。2.2 64个蓝莓品种指纹图谱的构建弓|物UBC841可以将64份供试材料完全区分 开来（图1）,构建了 64个蓝莓材料的DNA指纹 图谱（表3）。第1期张立杰等：64个蓝莓品种的ISSR分析13表1 64个蓝莓品种品种类型品种名编号33蓝线北高丛34普浮北高丛35米德北高丛36蓝金北高丛37蓝鸟北高丛38布里吉塔北高丛39陶柔北高丛40克莱顿北高丛41蓝丰北高丛42康维尔北高丛43红利北高丛44双迪北高丛45赫伯特北高丛46斯巴坦北高丛47木兰北高丛48斯坦露北
14、高丛49泽西北高丛50瑞卡北高丛51达柔北高丛52鲁贝尔北高丛53日出北高丛54早蓝北高丛55埃利奥特北高丛56尼尔森北高丛57伯克利北高丛58莱格西北高丛59斯维克矮丛60芝尼矮丛61美登矮丛62北极星半高丛63北村半高丛64北陆半高丛品种类型眼眼鈿鈿兔兔兔兔兔兔兔兔兔艮艮艮 艮 艮艮艮丛丛丛丛丛丛丛丛丛丛丛丛丛丛丛丛丛丛丛丛丛 高高高高高高高高高高高高高高高高高高高高高 南甫南甫南商南菌商菌朝南北北匕匕匕匕匕匕匕dd-d-d d d品种名编号1精华2灿烂3园蓝4蓝美人5布莱特蓝6顶峰7杰兔8乌达德9巴尔德温10奥斯汀11粉蓝12奥尼尔13比洛克西14南大15夏普兰16库帕17密斯提18布莱
15、登19阳光蓝20A11921威尔22乔治宝石23海岸24蓝塔25蓝源26迪克西27公爵28玫瑰蓝29伊丽莎白30钱德勒31维尔康32努益表2用于蓝莓品种遗传多样性分析的ISSR引物及其扩增结果5IW 序列（5,t。3，）统计条带数 多态性带数 多态百分率UBC807AGAGAGAGAGAGAGAGT1313100UBC810GAGAGAGAGAGAGAGAT1717100UBC825ACACACACACACACACT2121100UBC827ACACACACACACACACG55100UBC840GAGAGAGAGAGAGAGAGTT2525100UBC841GAGAGAGAGAGAGAGAY
16、C1919100UBC847CACACACACACACACARC171694.1UBC856ACACACACACACACAGGTA232295.7UBC881GGGTGGGGTGGGGTG2121100总计161159-平均17.917.798.814东南园艺第11卷1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112 131415 161718 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 3132 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47484950 51 M 52 53 54 55 56 57 58 59 60 6162 63 64 M图1 UBC841引物对64个蓝莓DNA的ISSR扩增图表3编号 弓I物UBC84164个蓝莓品种的ISSR数字指纹图谱编号 引物UBC841111001110010100010002110011101110000100030111111111100001000411000000111000001015110001110110000100161010010111000011011
