1、组织培养技术组织培养技术 Tissue Culture Techniques(In Vitro Culture)概述概述.绪言绪言/Introduction.细胞生长的根本需要细胞生长的根本需要/Basic requirement of cell growth .细胞培养的配备细胞培养的配备/Equipment.清洁、消毒与灭菌清洁、消毒与灭菌/Cleaning,Disinfection and Sterilization.无菌操作无菌操作/Aseptic technique.培养细胞的形态培养细胞的形态/Morphology of culture cell I.绪言绪言/Introducti
2、on 1.概念概念/Concept 2.开展史开展史/Developing history 3.应用应用/Application 1.概念概念 体外培养体外培养/In vitro culture 将动植物活体内取出的组织、细胞或器官等，放置将动植物活体内取出的组织、细胞或器官等，放置在类似体内生存环境中，使其维持、生长或繁殖的方在类似体内生存环境中，使其维持、生长或繁殖的方法。法。whole culture microorganism parasite organ culture parts culture tissue culture cell culture 器官培养器官培养/Organ
3、culture 体外器官原基或整个器官或局部器官的维持或生长，包括结构和功能上的维持和分化。The maintenance or growth of organ primordia or the whole or parts of an organ in vitro,in a way that may allow differentiation and preservation of the architecture and/or function.Organ culture 组织培养组织培养/Tissue culture 体外组织的维持或生长体外组织的维持或生长，包括结构和功能上包括结构和功
4、能上的维持和分化的维持和分化。The maintenance or growth of tissue in vitro,in a way that may allow differentiation and preservation of the architecture and/or function.组织块组织块O.51立方毫米立方毫米或薄片或薄片厚厚0.2 毫米毫米 细胞培养细胞培养/Cell culture 是指单细胞在体外培养是指单细胞在体外培养。This term is used to denote the growing of cell in vitro,including th
5、e culture of single cell.通常体外培养中的单细胞不再形成组织通常体外培养中的单细胞不再形成组织。细胞培养也称为组织培养细胞培养也称为组织培养tissue culture，二者可作为同义语使用二者可作为同义语使用。细胞培养的类型细胞培养的类型/Types of cell culture 1原代培养原代培养/Primary culture 2传代培养传代培养/Subculture cell line 1 Primary culture 直接来自活体的细胞直接来自活体的细胞组织或器官组织或器官的初次培养。的初次培养。A culture start from cells,tis
6、sues or organs taken directly from organisms.严格地说，是指成功传代之前的培养，此时的细胞保严格地说，是指成功传代之前的培养，此时的细胞保持原有细胞的根本性质，如果是正常细胞，仍然保持原有细胞的根本性质，如果是正常细胞，仍然保存二倍体数。存二倍体数。实际应用上，常把第一代至第十代以内的培养细胞统实际应用上，常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。称为原代细胞培养。新生大鼠肺成纤维细胞新生大鼠肺成纤维细胞原代原代 培养的天数：培养的天数：48h 48h 放大倍速：放大倍速：倒置显微镜倒置显微镜 X40X40 培养基种类：培养基种类：1640
7、+10%1640+10%小牛血清小牛血清 细胞状态与特征细胞状态与特征简述简述:细胞呈梭形，有伪足，边缘清晰整齐，贴壁生细胞呈梭形，有伪足，边缘清晰整齐，贴壁生长长 幼兔骨髓基质干细胞幼兔骨髓基质干细胞原代原代：细胞种类：幼兔骨髓基质干细胞细胞种类：幼兔骨髓基质干细胞 培养的天数：五天后培养的天数：五天后 放大倍数：倒置显微镜放大倍数：倒置显微镜 X40培养基种类：培养基种类：DMEM+20%胎牛血清胎牛血清细胞状态与特征简述细胞状态与特征简述:细胞呈梭形，有伪足，边缘清晰整齐，贴壁细胞呈梭形，有伪足，边缘清晰整齐，贴壁生长生长 传代传代/passage or subculture 将细胞从一
8、个培养瓶转移到另外一个培养瓶的过将细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养瓶的过程。程。当细胞增殖到达一定密度后，那么需要别离出一当细胞增殖到达一定密度后，那么需要别离出一局部细胞和更新营养液，否那么将影响细胞的局部细胞和更新营养液，否那么将影响细胞的继续生存继续生存 培养细胞的“一代培养细胞的“一代，不表示细胞分裂一次，而，不表示细胞分裂一次，而是指培养细胞从接种到再次转移培养的过程。是指培养细胞从接种到再次转移培养的过程。原代培养细胞的生命归宿原代培养细胞的生命归宿 原代培养期原代培养期 传代期传代期 衰退期衰退期 2Subculture 细胞系细胞系/Cell line 原代培养成功后的细胞，
9、传代再培养，称原代培养成功后的细胞，传代再培养，称细胞系。细胞系。有限细胞系有限细胞系/Finited cell line 无限细胞系无限细胞系/infinited cell line 有限细胞系有限细胞系/Finited cell line 细胞群体在体外生长有一定限度，即体外传细胞群体在体外生长有一定限度，即体外传代代passage or subculture到一定次数到一定次数时，细胞停止繁殖、衰退、死亡。时，细胞停止繁殖、衰退、死亡。一般情况下可传代一般情况下可传代10-50次。次。无限细胞系无限细胞系/infinited cell line 细胞群体能无限制生长下去，不进入衰退期。细
10、胞群体能无限制生长下去，不进入衰退期。肿瘤细胞系可无限增殖；正常细胞系可发生肿瘤细胞系可无限增殖；正常细胞系可发生自发转化，使细胞获得永久增殖的能力。自发转化，使细胞获得永久增殖的能力。Infinited cell line:Hela 细胞株细胞株cell straincell strain 用单细胞别离培养或通过筛选的方法，用单细胞别离培养或通过筛选的方法，从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物的培养物称为细胞株或标志物的培养物称为细胞株 体内培养体内培养/In vivo culture 是将活体的组织细胞、器官等取出，放置在是将活体的组织细胞、
11、器官等取出，放置在其它生物体内让其生长和发育的方法。其它生物体内让其生长和发育的方法。器官移植器官移植/transplantation 干细胞干细胞/stem cell 2.开展史开展史 1919世纪末，世纪末，2020世纪初世纪初 温生理盐水培养鸡胚髓板组织温生理盐水培养鸡胚髓板组织存活数天存活数天提出组织提出组织培养培养(tissue culture)(tissue culture)概念概念 1885 Roux 1885 Roux 血浆凝块试管中培养成年兔肝、肾、甲状腺、卵巢植血浆凝块试管中培养成年兔肝、肾、甲状腺、卵巢植块块3 3天天早期器官培养早期器官培养 1897 Loeb 1897
12、 Loeb 应用悬滴培养法，用动物血清培养狗的肉瘤细胞，存应用悬滴培养法，用动物血清培养狗的肉瘤细胞，存活约活约7272小时。小时。1906 Beebe1906 Beebe等等 短期存活，没有细胞的生长和增殖。短期存活，没有细胞的生长和增殖。悬滴法培养蛙胚神经组织悬滴法培养蛙胚神经组织存活了几个星期存活了几个星期,且从培养的细胞中长出了轴突且从培养的细胞中长出了轴突 完善了体外培养体系，体外培养技术的开始完善了体外培养体系，体外培养技术的开始 1907 Harrison 1907 Harrison 改进悬滴培养法培养鸡胚心肌细胞数年改进悬滴培养法培养鸡胚心肌细胞数年 将无菌操作技术将无菌操作技
13、术aseptic techniqueaseptic technique引入引入体外培养体外培养 发现动物体液中存在着对动物细胞生长有强烈发现动物体液中存在着对动物细胞生长有强烈促进作用的生长因子促进作用的生长因子 1912 Carrel 1912 Carrel 1950s 1950s 培养技术快速开展培养技术快速开展 无菌操作技术无菌操作技术/aseptic technique /aseptic technique 培养容器培养容器/culture flasks/culture flasks 抗生素抗生素/antibiotics/antibiotics 培养基培养基/medium/medium
14、 培养方法培养方法/culture methods/culture methodsmicrocarriermicrocarrier，hollow fiber culture hollow fiber culture 微栽体法微栽体法 WezelWezel 在在19671967 年首创年首创 固体微珠直径约在固体微珠直径约在5050 微米到数百微米之间微米到数百微米之间 将细胞悬液和微载体混合孵育将细胞悬液和微载体混合孵育,待细胞贴附于微载体上待细胞贴附于微载体上,再转移至培养液中培养再转移至培养液中培养 借助温和搅拌系统使细胞随载体均匀悬浮于培养液中，借助温和搅拌系统使细胞随载体均匀悬浮于培养
15、液中，细胞就能够在微载体外表迅速生长、增殖细胞就能够在微载体外表迅速生长、增殖,细胞浓度可细胞浓度可高达高达107107 个个/mlml。适于各种细胞的大规模培养适于各种细胞的大规模培养 空心纤维法空心纤维法:是是RichardRichard knazekknazek 等在等在19721972 年创立的年创立的 空心纤维是一种由硅胶、聚砜、聚丙烯等材料构建的可空心纤维是一种由硅胶、聚砜、聚丙烯等材料构建的可透性滤膜透性滤膜,外径约为外径约为1/1/3 33/3/4mm4mm,外表具有海绵状多外表具有海绵状多孔结构孔结构,既能使水分子、营养物质和气体透过既能使水分子、营养物质和气体透过,也能也能
16、使细胞在上面贴附生长。使细胞在上面贴附生长。当细胞密度到达当细胞密度到达107107 108108个个/mlml 时时,逐渐用无血清培养逐渐用无血清培养液代替含血清培养液。此时细胞不再增殖液代替含血清培养液。此时细胞不再增殖,但能正常但能正常生活并继续分泌所需的蛋白质或其他生物制品。生活并继续分泌所需的蛋白质或其他生物制品。在生产激素和单抗时被广泛应用。在生产激素和单抗时被广泛应用。3.应用应用 细胞生物学细胞生物学/cell biology/cell biology 形态、发育、营养、代谢、病变等 遗传学遗传学/genetics/genetics 染色体分析、细胞融合、杂交、转基因等 病毒学病毒学/virology/virology 病毒培养 免疫学免疫学/immunology/immunology 细胞因子 细胞毒试验细胞毒试验/cytotoxic test/cytotoxic test 检测有毒物质并判断其强弱检测有毒物质并判断其强弱对药品、化装品、对药品、化装品、食品添加剂、杀虫剂等进行筛选和平安评估食品添加剂、杀虫剂等进行筛选和平安评估 生物制品生物制品/biologic p
