1、3 3 细胞工程细胞工程 学习目的学习目的 了解制备植物细胞及微生物细胞的了解制备植物细胞及微生物细胞的原生质体并进行细胞融合的根本方法。原生质体并进行细胞融合的根本方法。学习如何进行动植物细胞及组织的培学习如何进行动植物细胞及组织的培养方法。认识单倍体植物的诱发及人养方法。认识单倍体植物的诱发及人工种子制备的根本要领。探讨植物脱工种子制备的根本要领。探讨植物脱除病毒的途径和检测手段。掌握利用除病毒的途径和检测手段。掌握利用动物体细胞克隆哺乳动物的根本做法动物体细胞克隆哺乳动物的根本做法及其重要意义。领会人类干细胞研究及其重要意义。领会人类干细胞研究的原理和光明前景。的原理和光明前景。3.1
2、细胞工程的根底知识与根本技术细胞工程的根底知识与根本技术 细胞工程细胞工程 3 细胞工程细胞工程 3.1.1 根底知识根底知识 原核细胞：原核细胞：DNA裸露，生长迅速，易于操裸露，生长迅速，易于操作；但具细胞壁，表达真核基因受一定限作；但具细胞壁，表达真核基因受一定限制。制。真核细胞：接近人类需要，但具细胞周期，真核细胞：接近人类需要，但具细胞周期，要同步化培养；生长慢，植物细胞和真菌要同步化培养；生长慢，植物细胞和真菌细胞具细胞壁。细胞具细胞壁。3.1.2 根本操作根本操作 3.1.2.1 无菌操作概念与技术无菌操作概念与技术 细胞工程细胞工程 3.1 细胞工程的根底知识与根本技术细胞工程
3、的根底知识与根本技术 无菌室布局、卫生、无菌室布局、卫生、消毒、超净台消毒、超净台 3.1.2.2 细胞培养技术细胞培养技术 取样取样 灭菌灭菌 培养培养 传代传代 收获收获 除菌除菌 取样取样 3.1.2.3 细胞融合技术细胞融合技术 原生质体原生质体 融合融合 筛选筛选 鉴定鉴定 细胞工程细胞工程 3.1.2 根本操作根本操作 3.2 3.2 植物细胞工程植物细胞工程 细胞工程细胞工程 3 细胞工程细胞工程 植物组织培养植物组织培养 悬浮细胞培养和次生代谢物生产悬浮细胞培养和次生代谢物生产 花药及单倍体植株培养花药及单倍体植株培养 原生质体制备与细胞融合原生质体制备与细胞融合 人工种子制备
4、人工种子制备 植物脱病毒技术植物脱病毒技术 3.2.1 植物组织培养植物组织培养 细胞工程细胞工程 3.2 植物细胞工程植物细胞工程 在无菌和人工控制营养及环境条件下研究植在无菌和人工控制营养及环境条件下研究植物的细胞、组织和器官以及控制其生长、发育的物的细胞、组织和器官以及控制其生长、发育的技术。技术。全世界通过植物细胞培养再生成植株已超过全世界通过植物细胞培养再生成植株已超过600种，已使许多具有重要经济价值的果树、药材、种，已使许多具有重要经济价值的果树、药材、蔬菜和花卉等实现商品化生产。蔬菜和花卉等实现商品化生产。离体的植物离体的植物器官、组织、器官、组织、细胞细胞 脱分化脱分化 愈愈
5、伤伤组组织织 再分化再分化 芽芽 根根 植植物物体体 培养培养 细胞工程细胞工程 3.2.1 植物组织培养植物组织培养 植物组培的根本过程植物组培的根本过程 细胞工程细胞工程 3.2.1 植物组织培养植物组织培养 选择适宜的外植体 外植体大小要适宜 外植体的部位影响分化能力和器官分化类型 外植体的年龄影响其分化率 同一植物不同部位的分化需不同的生长素/冲动素比例 不同物种的相同部位外植体分化能力不一样 3.2.1.1 预备阶段预备阶段 细胞工程细胞工程 3.2.1 植物组织培养植物组织培养 除菌与接种除菌与接种 自来水屡次漂洗自来水屡次漂洗 消毒剂处理消毒剂处理 无菌水反复冲无菌水反复冲洗洗
6、外植体外植体 无菌滤纸吸干无菌滤纸吸干 切割切割 无菌无菌外植体外植体 细胞工程细胞工程 3.2.1.1预备阶段预备阶段 小块外植体小块外植体 置培养基上置培养基上 培养培养 消毒剂消毒剂 使用浓度使用浓度/%去除去除 消毒时间消毒时间/min 灭菌效果灭菌效果 次氯酸钠次氯酸钠 2 容易容易 530 很好很好 次氯酸钙次氯酸钙 910 容易容易 530 很好很好 漂白粉漂白粉 饱和溶液饱和溶液 容易容易 530 很好很好 升汞升汞 0.11 较难较难 210 最好最好 酒精酒精 7075 容易容易 0.22 好好 过氧化氢过氧化氢 1012 最容易最容易 515 好好 溴水溴水 12 容易容
7、易 210 很好很好 硝酸银硝酸银 1 较难较难 530 好好 抗生素抗生素 450 mg/L 中等中等 3060 较好较好 常用消毒剂的使用和效果常用消毒剂的使用和效果 细胞工程细胞工程 3.2.1.1预备阶段预备阶段 根本组分根本组分 微量无机物微量无机物 微量有机物微量有机物 琼脂琼脂 细胞工程细胞工程 3.2.1.1预备阶段预备阶段 培养基配置培养基配置 添加较高浓度的生长素添加较高浓度的生长素 固体培养固体培养 液体培养液体培养 光照培养光照培养 黑暗培养黑暗培养 3.2.1.2 诱导去分化阶段诱导去分化阶段 细胞工程细胞工程 3.2.1 植物组织培养植物组织培养 吲哚乙酸吲哚乙酸I
8、AA,常用常用110mg/L 吲哚丁酸吲哚丁酸IBA,常用常用15 mg/L 2，4-D 2，4-二氯苯氧乙酸二氯苯氧乙酸，常用，常用10-510-7 mol/L 萘乙酸萘乙酸NAA，常用，常用1.0 mg/L 生长素类激素生长素类激素 细胞工程细胞工程 3.2.1.2 诱导去分化阶段诱导去分化阶段 细胞分裂素类激素细胞分裂素类激素 冲动素冲动素KT 6-苄氨基嘌呤苄氨基嘌呤6-BA 玉米素玉米素 先加少量先加少量碱液预溶碱液预溶 细胞工程细胞工程 3.2.1.2 诱导去分化阶段诱导去分化阶段 3.2.1.3 继代增殖阶段继代增殖阶段 移植扩增移植扩增 分割继代分割继代 细胞工程细胞工程 3.
9、2.1 植物组织培养植物组织培养 光照培养室光照培养室 细胞工程细胞工程 3.2.1.3 继代增殖阶段继代增殖阶段 生长素与细胞分裂素对于细胞生长与分化具生长素与细胞分裂素对于细胞生长与分化具有协同作用，它们的量以及比例的不同，对有协同作用，它们的量以及比例的不同，对细胞分化起着重要的作用。细胞分化起着重要的作用。外植体本身内源激素水平的差异，导致它们外植体本身内源激素水平的差异，导致它们分化时对培养基中所添加的这两种激素量及分化时对培养基中所添加的这两种激素量及其比例反响不尽相同。其比例反响不尽相同。3.2.1.4 生根长芽阶段生根长芽阶段 细胞工程细胞工程 3.2.1 植物组织培养植物组织
10、培养 细胞工程细胞工程 3.2.1.4 生根长芽阶段生根长芽阶段 保湿是关键保湿是关键 防止强光直射防止强光直射 温度适宜温度适宜 3.2.1.5 移栽成活阶段移栽成活阶段 细胞工程细胞工程 3.2.1 植物组织培养植物组织培养 手指玫瑰手指玫瑰 细胞工程细胞工程 3.2.1.5 移栽成活阶段移栽成活阶段 3.2.2 3.2.2 植物细胞培养和次生代谢物生产植物细胞培养和次生代谢物生产 细胞工程细胞工程 3.2 植物细胞工程植物细胞工程 植物细胞培养罐 产量产量 物物 种种 天然产物天然产物 细胞培养细胞培养 原植物原植物 橘叶鸡眼藤 蒽醌 900g/g干重 110 g/g干重 决明 蒽醌 鲜
11、重的0.334%种子干重的0.21%长春花 蛇根碱 干重的1.3%干重的0.26%三角叶薯蓣 薯蓣皂苷 26mg/g干重 20mg/g干块根 人参 人参皂角苷 鲜重的0.38%鲜重的0.3%3.3%烟草 烟碱 干重的3.4%干重的2%5%烟草 泛醌 0.5mg/g干重 16mg/g干叶 大红罂粟 蒂巴因 130mg/g干重 140mg/g干叶 细胞培养和原植物的天然产物量的比较细胞培养和原植物的天然产物量的比较 细胞工程细胞工程 3.2.2 植物细胞培养和次生代谢物的生产植物细胞培养和次生代谢物的生产 氨基酸、核酸、蛋白质、碳水化合物、脂类、维生氨基酸、核酸、蛋白质、碳水化合物、脂类、维生素、
12、有机酸素、有机酸 抗白血病药、抗肿瘤药、抗病毒药、抗微生物药、抗白血病药、抗肿瘤药、抗病毒药、抗微生物药、酶抑制剂酶抑制剂 色素、香料、甜味剂、鸦片、杀虫剂、激素、强心色素、香料、甜味剂、鸦片、杀虫剂、激素、强心苷、核苷酸苷、核苷酸 橡胶、阿司匹林、奎宁、可卡因橡胶、阿司匹林、奎宁、可卡因 从植物培养细胞中获得的各类物质从植物培养细胞中获得的各类物质 细胞工程细胞工程 3.2.2 植物细胞培养和次生代谢物的生产植物细胞培养和次生代谢物的生产 1.成批培养封闭式培养 优点：易于操作；次生代谢物含量高。缺点：效率低。2.半连续和连续培养 封闭式植物细胞培养系统封闭式植物细胞培养系统 3.2.2.1
13、悬浮培养悬浮培养 细胞工程细胞工程 3.2.2 植物细胞培养和次生代谢物的生产植物细胞培养和次生代谢物的生产 次生代谢物的积累和细胞分化具有正相关性次生代谢物的积累和细胞分化具有正相关性 细胞固定化有利于组织化的形成；细胞固定化有利于组织化的形成；细胞固定化有利于在细胞团内外形成化学物质和细胞固定化有利于在细胞团内外形成化学物质和物理因素的梯度，这是高产次生代谢物的关键；物理因素的梯度，这是高产次生代谢物的关键；细胞固定化有利于对外环境参数进行调控；细胞固定化有利于对外环境参数进行调控；细胞固定化有利于回收次生代谢物。细胞固定化有利于回收次生代谢物。3.2.2.2 固定化细胞培养系统固定化细胞
14、培养系统 细胞工程细胞工程 3.2.2 植物细胞培养和次生代谢物的生产植物细胞培养和次生代谢物的生产 平床培养系统平床培养系统 优点：制作简单；优点：制作简单；能生产较屡次生代能生产较屡次生代谢物。谢物。缺点：占地面积大；缺点：占地面积大；分化区比例分化区比例较小；较小；02供给受限。供给受限。细胞工程细胞工程 3.2.2.2 固定化细胞培养系统固定化细胞培养系统 褐藻酸钙固定细胞褐藻酸钙固定细胞 无菌大量培养植物细胞无菌大量培养植物细胞 等量混合等量混合注入尼注入尼龙网龙网 配制配制4%褐藻酸钠，灭菌褐藻酸钠，灭菌 氯化钙溶液氯化钙溶液2%浸浴浸浴 褐藻酸钙固定的细褐藻酸钙固定的细胞团胞团
15、立柱培养系统立柱培养系统 细胞工程细胞工程 3.2.2.2 固定化细胞培养系统固定化细胞培养系统 立柱培养系统示意图立柱培养系统示意图 细胞工程细胞工程 3.2.2.2 固定化细胞培养系统固定化细胞培养系统 立柱培养系统操作要素立柱培养系统操作要素 取静止期细胞，并使细胞到达一定密度；取静止期细胞，并使细胞到达一定密度；控制营养液的成分控制营养液的成分包括激素包括激素、浓度及、浓度及O2供给；供给；某些种的细胞培养需光照；某些种的细胞培养需光照；尽可能选择次生代谢物能自然或诱导后从细胞尽可能选择次生代谢物能自然或诱导后从细胞内释出的植物内释出的植物品种品种。细胞工程细胞工程 3.2.2.2 固
16、定化细胞培养系统固定化细胞培养系统 3.2.3 3.2.3 植物原生质体制备与融合植物原生质体制备与融合 细胞工程细胞工程 3.2 植物细胞工程植物细胞工程 植物原生质体 几个名词：几个名词：原生质体原生质体protoplast):去除全部细胞壁的细胞去除全部细胞壁的细胞 亚原生质体亚原生质体subprotoplast):只含有局部原生质的只含有局部原生质的原生质体原生质体有核或无核有核或无核 微原生质体微原生质体miniprotoplast):经细胞松弛素经细胞松弛素B处理处理得到的仅含少量胞质及核或染色体的小原生质体得到的仅含少量胞质及核或染色体的小原生质体 原生质球原生质球球状体，球状体，spheroplast):残存少量细胞壁残存少量细胞壁的原生质体的原生质体 细胞工程细胞工程 3.2.3 植物原生质体制备与融合植物原生质体制备与融合 外植体除菌外植体除菌 外植体酶解外植体酶解纤维素酶为主纤维素酶为主 除菌后叶片除菌后叶片 撕去下表皮撕去下表皮 切块放入反响切块放入反响 不时轻摇不时轻摇 反响液转绿反响液转绿 细胞工程细胞工程 3.2.3 植物原生质体制备与融合植物原生质体制备
