1、细胞培养技术 药物科学与技术学院 周立军 参考书目?细胞培养?，世界图书出版公司，1996年?培养细胞学与细胞培养技术?，上海科学技术出版社，2004年 本次课内容 细胞培养的根本知识 一、绪论 培养法的种类、培养法的开展、细胞培养的常用术语、培养细胞的作用及意义、培养法的应用 二、培养细胞的特征 培养细胞的生长方式和类型、培养细胞的生长特点和生长增殖过程、细胞培养的条件及影响因素 一、绪论 细胞培养技术是选用各种细胞的最正确生存条件对活细胞进行培养和研究的技术。即：从活体中取出小块组织别离出细胞，在一定条件下进行培养，使之能继续生存、生长、增殖的一种方法。涉及有细胞生物学、生物化学与分子生物
2、学、动物学与植物学、病原学、肿瘤学、遗传学、生物工程学甚至光学、物理学等等学科。因其涉及面很广所以已经渗透到生命科学的各个领域。细胞培养细胞培养cell culture)cell culture)组织培养的概念 组织培养tissue culture：其本意是指从体内取出组织和细胞，模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。器官培养Organ culture：指的是应用和组织培养相似的条件，培养的是器官的原基、器官的一局部或整个器官，使之在体外生存、生长和保持一定功能的方法，以上三个层次的培养，又可统称之为体外培养in vitro。培养法的种类
3、体外培养 细胞培养 组织培养 器官培养 贴壁培养 悬浮培养 体体 外外 培培 养养 种种 类类 细胞培养可分为群体培养和克隆培养两种。细胞培养可分为群体培养和克隆培养两种。群体培养群体培养mass culture：即将大量细胞置于培：即将大量细胞置于培养瓶中，让其贴壁或悬浮生长，形成均匀的单层细养瓶中，让其贴壁或悬浮生长，形成均匀的单层细胞或单细胞悬液。胞或单细胞悬液。克隆培养克隆培养clone culture：即将少数细胞参加培：即将少数细胞参加培养瓶中，贴壁后彼此间隔距离较远，经过繁殖每一养瓶中，贴壁后彼此间隔距离较远，经过繁殖每一个细胞形成一个集落，称为克隆。个细胞形成一个集落，称为克隆
4、。群体培养左和克隆培养右群体培养左和克隆培养右 原代培养第原代培养第4天，成纤维样细胞散布于培养瓶底，天，成纤维样细胞散布于培养瓶底，个别集落形成，细胞围绕中心漩涡状排列个别集落形成，细胞围绕中心漩涡状排列100 原代培养第原代培养第7天，多个集落形成并融合天，多个集落形成并融合100 培养法的开展 组织培养法的开展经历近百年。德国人Roux1885用温生理盐水体外培养鸡胚组织并存活数月被认为是组织培养的萌芽试验。1903年Jolly用盖片悬滴培养法，培养蝾螈白细胞生活一个月，提示组织或细胞离体后，在人工培养条件下，仍能生存。培养法的开展 关于神经轴突的结构和形成有争议。哈里森生理学家首先解剖
5、了蛙胚的原始脊髓节段在淋巴液中进行培养。在显微镜下观察到从神经芽细胞延伸出神经轴突的状况。建立起一套合理的无菌培养技术 哈里森悬滴培养法 哈里森悬滴培养法 培养物 凝固的淋巴 凹玻片槽 盖玻片 将蛙胚原始脊髓节段，移到事先滴有从成体蛙淋巴囊吸取的新鲜淋巴将蛙胚原始脊髓节段，移到事先滴有从成体蛙淋巴囊吸取的新鲜淋巴的盖玻片上，的盖玻片上，淋巴很快凝固，使组织小块固定在一定的位置上。淋巴很快凝固，使组织小块固定在一定的位置上。然后将盖玻片倒置于一块中央凹陷的厚载玻片上，盖玻片的周缘用蜡然后将盖玻片倒置于一块中央凹陷的厚载玻片上，盖玻片的周缘用蜡封固。封固。蛙胚神经组织存活了数周蛙胚神经组织存活了数
6、周体外培养组织和细胞的根本模式系统。体外培养组织和细胞的根本模式系统。卡氏瓶的创造 Carrel用反复传代的方法使细胞系存活34年。他采用的无菌技术，以及后来设计的培养瓶卡氏瓶，Carrel flask等都是对组织培养的重要奉献。特别是他的连续培养，为后来的传代培养奠定了根底。组织培养发展示意图组织培养发展示意图 19231923年，年，CarrelCarrel设计设计了卡式瓶培养法，扩了卡式瓶培养法，扩大了组织的生存空间。大了组织的生存空间。19241924年年MaximowMaximow的双盖的双盖片培养法，使之更易片培养法，使之更易于传代和减少污染。于传代和减少污染。19571957年年
7、Dulbecco Dulbecco 等采用胰蛋白酶消化处理和应用等采用胰蛋白酶消化处理和应用液体培养基的方法，获得了的单层细胞培养，单液体培养基的方法，获得了的单层细胞培养，单层培养成了组织培养普遍应用的技术。促进了细层培养成了组织培养普遍应用的技术。促进了细胞系胞系(cell line)(cell line)的建立。的建立。近年各种条件已商品化系列化，应用冷冻技术，近年各种条件已商品化系列化，应用冷冻技术，各国建立细胞库各国建立细胞库 我国组织培养的开展我国组织培养的开展 2020世纪世纪3030年代传入我国。年代传入我国。2020世纪世纪5050年代起步。年代起步。2020世纪世纪7070
8、年代，成为医学和生物学研究年代，成为医学和生物学研究中应用的手段。中应用的手段。组织培养常用术语组织培养常用术语 原代培养primary culture：从直接取自生物体细胞、组织或器官开始的培养。传代培养passage culture：将细胞以一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶即称为传代培养。注：传代passage，subculture 原代培养 胎儿细胞培养比成人容易；成体组织中成纤维细胞、肾上皮细胞比较容易，上皮细胞培养难。细胞间的别离酶：胰蛋白酶、胶原酶、单一种类细胞的别离培养：根据培养条件培养基、细胞接着面的条件、接着速度、离心法等。细胞系细胞系cell line：原代培养经首次传代
9、成功：原代培养经首次传代成功后即成细胞系，由原先存在于原代培养物中的后即成细胞系，由原先存在于原代培养物中的细胞世系所组成。细胞世系所组成。细胞株细胞株cell strain：通过选择法或克隆形成：通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的特殊性质或法从原代培养物或细胞系中获得的特殊性质或标志，并能稳定保持这些特性的培养物。标志，并能稳定保持这些特性的培养物。克隆克隆clone：指单个细胞通过有丝分裂所产：指单个细胞通过有丝分裂所产生的遗传性状相同的细胞群体。生的遗传性状相同的细胞群体。有分化特性的细胞系和细胞株有分化特性的细胞系和细胞株 组织组织来源来源 细细胞系胞系 增殖性增殖性
10、物种物种 分化特性分化特性 脾脾 Friend 永生永生 小鼠小鼠 合成血红蛋白合成血红蛋白 Morris肝癌肝癌 HTC 永生永生 大鼠大鼠 酪氨酸转移酶诱导酪氨酸转移酶诱导 髓性白血病髓性白血病 K562 永生永生 人人 合成血红蛋白合成血红蛋白 垂体瘤垂体瘤 GH2,GH3 永生永生 大鼠大鼠 产生生长激素产生生长激素 黑色素瘤黑色素瘤 B16 永生永生 小鼠小鼠 产生色素产生色素 髓性白血病髓性白血病 HL60 永生永生 人人 合成球蛋白合成球蛋白 胶质瘤胶质瘤 CCM 永生永生 人人 胶质纤维酸性蛋白胶质纤维酸性蛋白 成神经细胞瘤成神经细胞瘤 C1300 永生永生 大鼠大鼠 生长轴突
11、生长轴突 对细胞培养技术的评价 优点：优点：1、活细胞：、活细胞：能长时间、直接观察、研究活细胞的形能长时间、直接观察、研究活细胞的形态、结构、生命活动；态、结构、生命活动；2、可控制：、可控制：选择对象：均一性、重复性类型、性选择对象：均一性、重复性类型、性质、阶段质、阶段；调节条件：各种因素物理、化学、生调节条件：各种因素物理、化学、生物等因素；物等因素；利用方法：研究技术、记录方法；利用方法：研究技术、记录方法；3、应用广：、应用广：领域多：医学研究、生物技术、基因工领域多：医学研究、生物技术、基因工程等程等 对象广：各种动物低等动物对象广：各种动物低等动物-高等动物高等动物-人类人类
12、一种动物不同年龄、不同组织一种动物不同年龄、不同组织 正常或异常肿瘤正常或异常肿瘤 4、较经济：、较经济：可提供大量、同时、重复性好的、生物学可提供大量、同时、重复性好的、生物学性状相似的实验对象；性状相似的实验对象；缺点：缺点：1、培养细胞会发生改变；2、对人员、设备等要求较高。与体内主要不同 相对孤立、相对单一、缺乏体内的系统作用、失去神经体液的调节和细胞相互间的影响。主要表现 失去原有组织结构和细胞形态、分化减弱、细胞趋向单一化。提示 要正确认识体外培养细胞是一种特定条件下生长的细胞群体。对细胞培养技术的评价 细胞培养技术的研究、观察内容 细胞内活动：例如能量的代谢、细胞内活动：例如能量
13、的代谢、DNA转录、凋亡及蛋白合成等。转录、凋亡及蛋白合成等。细胞内部与细胞外界之间的作用：如细胞对外界刺激的反响、药细胞内部与细胞外界之间的作用：如细胞对外界刺激的反响、药物对细胞的作用、细胞内产物的分泌等。物对细胞的作用、细胞内产物的分泌等。细胞间的相互作用：如形态发生、细胞间的粘着作用、接触抑制、细胞间的相互作用：如形态发生、细胞间的粘着作用、接触抑制、密度抑制等。密度抑制等。细胞内的流动：如信号传导、钙离子的流动、细胞内的流动：如信号传导、钙离子的流动、RNA的移动、激素的移动、激素受体复合物的易位等。受体复合物的易位等。遗传学：如遗传分析、转染、转化等。遗传学：如遗传分析、转染、转化
14、等。细胞培养的应用领域细胞培养的应用领域 一、在病毒学研究中的应用一、在病毒学研究中的应用 二、在免疫学研究中的应用二、在免疫学研究中的应用 三、在分子生物学研究中的应用三、在分子生物学研究中的应用 四、在遗传学研究中的应用四、在遗传学研究中的应用 五、在药理学研究中的应用五、在药理学研究中的应用 六、在毒理学研究中的应用六、在毒理学研究中的应用 七、在肿瘤学研究中的应用七、在肿瘤学研究中的应用 八、在器官移植中的应用八、在器官移植中的应用 病毒病毒检验检验方法方法 病毒培病毒培养养全程全程5 5-3030天天 细细胞病胞病变判定变判定 荧荧光染色：光染色：1.1.病毒病毒涂涂片片 2.2.血
15、清型血清型专专一一 抗抗体荧体荧光染色光染色 中和中和试验试验：培培养养出出的的病毒病毒与与血清型血清型专专一性抗一性抗血清作用，再接血清作用，再接种种至至细细胞胞 病毒培病毒培养养：1.1.细细胞培胞培养养 2.2.接接种种至至细细胞胞 检测病毒 C P E 正常细胞正常细胞 病变细胞病变细胞 杂交瘤技术杂交瘤技术Hybridomas 免疫学免疫学 脾细胞脾细胞(B淋巴细胞淋巴细胞)骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞 杂交瘤细胞杂交瘤细胞 长命长命 不分泌抗体不分泌抗体 分泌抗体分泌抗体 短命短命 分泌抗体分泌抗体 长命长命 Khler和和Milstein,1975 1984年年Nobel医学奖医学奖 培
16、养上清中培养上清中X X抗体的检测抗体的检测 克隆化培养克隆化培养 单克隆杂交瘤细胞培养上清中单克隆杂交瘤细胞培养上清中X X抗体的检测抗体的检测 杂交瘤细胞可持续分泌单克隆抗体杂交瘤细胞可持续分泌单克隆抗体 规模化培养规模化培养 获得大量单克隆抗体获得大量单克隆抗体 动物免疫动物免疫 细胞融合细胞融合 混合细胞的混合细胞的HATHAT筛选筛选)分泌分泌X X抗体抗体 B B淋巴细胞淋巴细胞 骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞 X X抗原抗原 B B淋巴细胞淋巴细胞 瘤的突变株瘤的突变株 培养数天后细胞死亡培养数天后细胞死亡 无限生长细胞无限生长细胞 分泌分泌 X X抗体抗体 只有杂交瘤细胞可长期存活下来只有杂交瘤细胞可长期存活下来 BALB/c 单克隆抗体制备单克隆抗体制备 免疫学免疫学 在分子生物学研究中的应用在分子生物学研究中的应用 1 1、体外培养细胞的转化体外培养细胞的转化 2 2、DNADNA转导技术转导技术 3 3、基因诊断和基因治疗、基因诊断和基因治疗 器官移植器官移植组织工程组织工程 种子细胞干细胞种子细胞干细胞 支架材料支架材料 组织工程组织工程 二、培养细胞的根本特征二、培养细
