1、福建畜牧兽医第45卷第1期2023年不同批次新生牛血清对 MDCK 细胞培养效果的研究康碧静1,2,3马芳芳1,2,3马春英1,2,3马忠仁1,2乔自林1,2王家敏1,2*（1.西北民族大学生物医学研究中心甘肃省动物细胞技术创新中心兰州730030；2.西北民族大学生物工程与技术国家民委重点实验室兰州730030；3.西北民族大学生命科学与工程学院兰州730030）摘要为筛选适宜MDCK细胞生长的最佳血清，分析6个批次新生牛血清在两种培养方式即贴壁静置培养条件下MDCK细胞的生长状态、平均集落形成率及微载体悬浮培养条件下MDCK细胞的生长状态、生长速率、生长动力学情况。结果表明6组新生牛血清贴
2、壁静置培养的MDCK细胞，平均集落形成率最大的为第组，最小的为第组，由大到小依次为第、组；微载体悬浮培养条件下的MDCK细胞，最大增殖密度从大到小依次为第、组，平均倍增时间由大到小依次为第、组。因此，通过对不同批次血清贴壁静置培养的MDCK细胞生长状态、平均集落形成率及微载体悬浮培养的MDCK细胞生长状态、生长动力学评价，筛选出适宜细胞生长的新生牛血清批次为第、组，而第组新生牛血清对细胞生长的促进效果不明显，细胞生长状态不佳。关键词新生牛血清MDCK细胞生长曲线文献标识码：A文章编号：1003-4331（2023）01-0001-05Effect of different batches of
3、 newborn bovine serum on MDCK cellKang Bijing1,2,3Ma Fangfang1,2,3Ma Chunying1,2,3Ma Zhongren1,2Qiao Zilin1,2Wang Jiamin1,2*(1.Gansu Tech Innovation Center of Animal Cell,Biomedical Research Center,Northwest Minzu University,Lanzhou 730030;2.KeyLaboratory of Biotechnology and Bioengineering of State
4、 Ethnic Affairs Commission,Biomedical Research Center,Northwest MinzuUniversity,Lanzhou 730030;3.Life Science and Engineering College of Northwest Minzu University,Lanzhou 730030)AbstractIn order to screening of newborn bovine serum(NBS)suitable for MDCK growth,analyzed adherent cultured MDCK cells
5、insix batches of NBS the growth status and average cloning of growth rate,analyzed the growth status,growth rate,growth kinetics ofMDCK cells in microcarrier suspension culture.The results show that adherent cultured MDCK cells,which the highest averagecloning of growth rate is group,the lowest is g
6、roup,in descending order of,the maximum proliferation densityof MDCK cells in microcarrier suspension cultured in descending order of,the average doubling time in descendingorder of,.Therefore,evaluate adherent MDCK in six batches of NBS the growth status,average cloning of growth rateand MDCK cells
7、 in microcarrier suspension cultured the status,growth kinetics,screening of NBS suitable for MDCK growth were,.Group NBS for the promotion of cell growth effect were not obvious,the cells were not growing well.Key wordsNew bovine serumMDCK cellsGrowth curveMDCK细胞1958年由Madin S H和Darby N B从可卡犬的肾脏组织中分
8、离而来，在体外形成自发永生化，20世纪90年代，MDCK细胞成为WHO推荐的生产流感疫苗的细胞系之一1。目前，由MDCK细胞所生产的流感疫苗主要有：Influvac、Optaflu、Flucelvax Tetra等，但目前我国市场上没有细胞基质流感疫苗2。在细胞培养的过程中，血清是常用的添加剂，通常是以5%10%（V/V）浓度添加于培养基中，可促进贴壁依赖性细胞的附着生长3。但是由于不同原材料的差异、不同生产厂商质量控制差异等因素，不同厂商甚至同一厂商的不同批次之间血清有成分上的差异，会影响细胞的生长4。因此，筛选合适的血清对于生物产业至关重要。1987年，牛春燕等5就使用sp2/0细胞生长情
9、况来筛选不同批次的血清质量，5%血清浓度下筛选出6批细胞长势良好的血清批次，且发现10%血清浓度下细胞活率大于5%、1%血清浓度所培养的细胞。高丽美等6使用人二倍体细胞筛选血清，除了细胞生长曲线外，还做了生长促进试验，更客观地反映了血清促生长能力。张豆等7使用5种方法进行疫苗生产用血清的筛选，丰富了血清的筛选方法，为疫苗生产的血清筛选提供了参考。在此基础上，本试验在贴壁培养筛选的基础上使用微载体悬浮培养MDCK细胞的方式基金项目：西北民族大学中央高校基本科研业务费专项资金项目（31920210053）资助。作者简介：康碧静（1997-），女。甘肃天水人，在读硕士，研究方向：动物细胞培养工程。*
10、通信作者：王家敏（1987-）。在读博士，讲师。研究方向：细胞 工 程（疫 苗 方 向），E-mail:jiamin-。RRR1福建畜牧兽医第45卷第1期2023年来筛选合适的血清批次，为微载体培养细胞作基础性研究。1材料和方法1.1材料与仪器MDCK细胞（由ATCC引进，引进后由本实验室建库保存）；微载体（Cytodex1，购自GE Healthcare，货号17-0488-03，批号10225274）；DEME（批号20170318）、0.25%胰蛋白酶、磁力搅拌器（CYTOTEK-CellStirrer），均购自兰州百灵生物；0.2%台盼蓝；结晶紫染液；试验用优级新生牛血清：组 的 批
11、次 分 别 为20160310、20160811、20161011、20161025、20161130、20161220，均购自兰州民海生物；250 mL悬浮培养瓶（兰州百灵塑料）；生物微倒置显微镜（Olympus，CKX-41）；CO2培养箱（ThermoFisher，3111型）；细 胞计 数 仪（Countstar，IC1000）等。1.2方法1.2.1贴壁培养MDCK细胞传代稳定性复苏MDCK细胞于含10%（V/V）新生牛血清的DMEM中，待细胞生长致密，用0.25%胰蛋白酶消化，中止消化后制成细胞悬液，分别使用含6个批号新生牛血清的DMEM按1:6比例传代10代，每代24 h、48
12、h拍照，观察其长势。1.2.2贴壁培养的MDCK细胞克隆形成率分析取第5代贴壁培养的MDCK细胞，使用0.25%胰蛋白酶消化，制成细胞悬液，计数后稀释，按50个细胞/皿的密度均匀铺在平皿中，在CO2培养箱中放置8 d，后又吸去培养基，PBS洗三遍，固定，染色，记录平皿中集落，计算克隆形成率。克隆形成率（%）=（所形成集落数/接种细胞数）100%。1.2.3微载体悬浮培养的MDCK细胞生长状态、生长曲线及生长动力学测定取培养至第3、6、9代的贴壁细胞，消化计数后，接种在含有Cytodex1微载体的培养基内，密度为2 g/L，体积为200 mL，细胞接种密度为15个细胞/球，50 r/min、5%
13、CO2、37 条件下培养，每24 h取样观察细胞生长状态，结晶紫计数。取三次平均值，绘制其生长曲线，计算平均倍增时间8、平均比生长速率9。倍增时间=T/A，A=log2（Y/X），X为初始接种细胞数，Y为细胞最大增殖密度前一天的细胞数，T为培养时间；比生长速率=（lnXn/Xn-1）/（tntn1），X为活细胞密度，t为培养时间，n和n1为2个取样计数时间点。1.3数据分析使用Graphpad prism 8软件进行统计学分析，计量资料以均数标准差表示，采用t检验，以P0.05为差异有统计学意义。2结果与分析2.1贴壁培养的MDCK细胞传代稳定性复苏后的MDCK细胞见图1，细胞长势良好，细胞边
14、界清晰，分布较为均一。使用含不同批次新生牛血清的DMEM进行培养，传代5次，每个代次生长状态见表1。第组血清培养MDCK细胞状态不佳，细胞核仁变大，细胞界限不明显；其余5组细胞长势良好，细胞呈经典铺路石状，细胞边界清晰，细胞镶嵌紧密，大小均一。根据贴壁细胞生长状态可以得出结论，除第组外，其余5组血清均能较好促进细胞生长。（A：24 h，40；B：48 h，40）图1MDCK细胞复苏状态表16个批号新生牛血清分别培养MDCK细胞（第5代）效果比较（100）组别细胞培养效果（第5代）24 h48 h2福建畜牧兽医第45卷第1期2023年2.2贴壁细胞克隆形成率的计算计算6个批次的血清形成的细胞集落
15、，从高到低依次为第、组，分别为88%，80%，78%，70%，60%，30%。除第组外，其余各组克隆形成率在60%以上，见图2-图3。因此，第组均能促进MDCK细胞增殖，第组血清对于低密度细胞生长促进效果不明显。图36个批号新生牛血清培养MDCK细胞克隆率比较2.3微载体悬浮培养MDCK细胞生长状态、生长曲线及生长动力学分析对第3、6、9代贴壁MDCK细胞进行微载体悬浮培养，培养效果见表2。第48 h时，细胞开始覆盖微载体的表面，第组细胞数量相比其他批次较少，第、组细胞覆盖微载体表面数量较多。到120 h，除第组外，其余各组血清培养的微载体都出现结团现象，细胞镶嵌致密，第组细胞有脱落现象，细胞
16、数量稀少，状态不佳，其生长曲线见图4。除第组外，其余各组血清生长曲线近“S”形。最大增殖密度，除第组外，其余组细胞密度都在1.4106 cells/mL以上，最大增殖密度无显著差异，与第组相比差异极显著；平均倍增时间，除第组外，其余5组间无显著性差异，而与第组相比均差异显著；平均比生长速率，组间无显著性差异，与第组相比均差异显著（见表3、图5-图7）。结果表明，除第组外，第、组均能促进MDCK细胞在微载体培养时的增殖。3结论与讨论通过MDCK细胞贴壁培养及微载体悬浮培养的方式对6组新生牛血清进行筛选，发现第组血清培养的贴壁MDCK细胞状态不佳，微载体悬浮培养的细胞数量比其他5组有显著性差异，因此，本试验筛选出适合细胞培养的血清为第、组。血清中含有细胞生长、分化相关的激素，如氢化组别细胞培养效果48 h120 h图26个批号新生牛血清培养MDCK细胞形成的集落表26个批号新生牛血清分别培养MDCK细胞效果比较（100）图4MDCK细胞生长曲线3福建畜牧兽医第45卷第1期2023年可的松、地塞米松、胰岛素等，研究发现血清中胰岛素可以通过活化蛋白激酶及磷酸激酶等联级反应促进细胞增殖、分化，1
