1、 50 海洋科学/2022 年/第 46 卷/第 12 期 不同铁浓度对一种颗石藻 Emiliania huxleyi 的生长及光合作用的影响 任庆敏1,2,林燕妮4,王寅初1,3,5,秦 松1,3,5(1.中国科学院烟台海岸带研究所,山东 烟台 264003;2.中国科学院大学,北京 100049;3.国家基础学科公共科学数据中心,北京 100190;4.烟台大学,山东 烟台 264005;5.中国科学院海洋大科学研究中心,山东 青岛 266071)摘要:为探讨铁对颗石藻生长及光合作用的影响,以分离于秘鲁上升流区域的两株不同基因型的赫胥黎艾氏藻 Emiliania huxleyi RCC66
2、60 与 RCC6666 为研究对象,在调整 5 种铁浓度(0、50、100、500、1 000 nmol/L)的 Aquil 培养基中培养,比较其生长率、色素含量、营养盐消耗、颗粒有机物含量及叶绿素荧光特性参数的差异。实验结果表明:铁浓度未对两株藻的生长产生显著影响,但 0 nmol/L 时RCC6660 的比生长率显著高于 RCC6666(P18 Mcm1),所有容器都经过酸洗,然后用 Q-H2O 重复洗涤五次以上27。为防止高温灭菌引入的铁污染,培养基使用0.22 m 孔径的一次性无菌过滤器过滤除菌,弃掉前200 mL 滤液。1.1.3 培养条件培养条件 培养基在使用之前,将盐度调整为
3、35,通过添加NaHCO3将溶解无机碳(DIC)调整为 2 000 molkg1。藻株使用密闭盖的 175 cm2聚碳酸酯细胞培养瓶进行培养,光照条件为 100 mol photonsm2s1(14L10D),温度为 20。将封闭的培养物每天摇动 3 次并随机交换位置以确保细胞受光均匀。在正式实验之前,细胞在对应的铁浓度下进行两次适应性驯化,即让细胞从 103 cells/mL 增殖至 5104 cells/mL(不大于 105 cells/mL),以适应实验条件。在正式实验时,以 103 cells/mL 的浓度接种,当细胞浓度到达 5 104 cells/mL(不大于 105 cells/
4、mL)时测量光合生理并收样测定其他参数。1.2 实验方法实验方法 1.2.1 细胞生长率与粒径、体积细胞生长率与粒径、体积 每天固定时间使用 0.1 mL 浮游生物计数框对细胞计数来确定细胞密度。比率生长速率()如下测定:=(lnC2lnC1)/(T2T1),其中 C2和 C1分别代表 T2和T1的细胞浓度。实验结束后取样,使用流式细胞摄像系统 FlowCAM(fluid imaging technologie,US)测量细胞粒径及体积。1.2.2 细胞色素细胞色素 在 GF/F 滤膜(Millipore,US)上过滤 100 mL 培养物,将膜折叠后放入离心管中,加入 4 mL 100%甲醇
5、并置于 4 冰箱中提取过夜,然后在 4 下离心 10 分钟(6 700 r/min)。使用扫描分光光度计扫描上清液在 200800 nm 的吸收28。使用下列公式计算叶绿素 a(a)29、叶绿素 c(c)30和类胡萝卜素(r)31的浓度(gmL1):a=16.29(A665A750)8.54(A652A750).(1)c=28.8191(A632A750)6.0138(A665A750).(2)r=7.6(A480A750)1.49(A510A750).(3)1.2.3 碳酸盐系统及营养分析碳酸盐系统及营养分析 用玻璃纤维过滤器(Whatman GF/F)过滤所得的 52 海洋科学/2022
6、年/第 46 卷/第 12 期 滤液进行 DIC 和营养盐测定。DIC 使用总有机碳分析仪(Shimadzu TOC-VCPH)测量;使用连续流动分析仪(Seal-Branlubbe AA3,Seal Germany)测量硝酸盐和磷酸盐的浓度。1.2.4 颗粒有机碳颗粒有机碳(POC)及颗粒有机氮及颗粒有机氮(PON)含量测定含量测定 颗石藻细胞使用预燃烧(450,12 h以上)的玻璃纤维滤膜通过抽滤收集,每组收集 100 mL。测量前添加 230 L 的 0.1 mol/L 盐酸以除去膜上的无机碳,用以测量 POC 和 PON。滤膜在 60 烘箱中烘干 2 h 之后,使用锡纸包裹并在元素分析
7、仪中进行测定。将细胞的 PON 和 POC 含量乘以生长速率(),以计算 PON生产速率(PPIN)和 POC 生产速率(PPOC)。1.2.5 叶绿素荧光叶绿素荧光 藻细胞暗适应 15 min 之后,使用叶绿素荧光仪(AquaPen-C,捷克 PSI)测量叶绿素荧光参数,包括最大光化学效率(Fv/Fm)、有效光化学效率(YPSII)和非光化学淬灭(NPQ)。快速光响应曲线设置 6 个光强梯度(10,20,50,100,300,500 mol photonsm2s1),每个光强 60 s,相对电子传递速率(rETR)的计算公式如下32:E=YPSIIp0.5,(4)式中,p 指代提供光化学光的
8、光合有效辐射(PAR),E 为rETR。将 rETRPAR 数据导入到 SigmaPlot(v13.0)后,使用双指数衰减(double exponential decay)方程进行回归拟合33-34,并得到各项特征参数,包括最大相对电子传递速率(rETRmax)、饱和光强和表观光能利用率。1.3 数据处理数据处理 采用 IBM SPSS Statistics 26.0 数据统计软件进行数据,不同铁浓度处理间的差异用方差分析、多重比较,两个藻种之间的差异用 t-检验分析,以 P0.05),而对于 株,50 nmol/L 才是其最适铁浓度(P0.05)。铁浓度为 0 nmol/L 时,株的比生长
9、率显著高于 株(P 0.05),而在铁浓度为 50 nmol/L 时,株的比生长率显著低于 株(P0.05),高铁浓度(100 nmol/L)反而抑制了细胞的最大粒径,使其表现为减小的趋势。在不同铁浓度培养中,株的最小粒径均小于 株,且在 0 nmol/L 和 100 nmol/L 时具有显著性(P0.05)。两藻株在铁浓度为 100 nmol/L 时,细胞平均粒径和平均体积最大(P0.05)。且在各个铁浓度中,株的平均体积都更大(P0.05)。图 2 五种实验铁浓度对 RCC6660()和 RCC6666()的比生长率的影响 Fig.2 Effects of five experimenta
10、l iron concentrations on specific growth rates of RCC6660()and RCC6666()注:数值为平均值标准差,n=3。不同字母表示单一藻株不同铁浓度之间具有显著性差异(P0.05),柱状图上的横线表示两个藻株之间有显著性差异(P0.05)图 3 五种实验铁浓度对 RCC6660()和 RCC6666()的细胞粒径和细胞体积的影响 Fig.3 Effects of five experimental iron concentrations on cell particle size and cell volume of RCC6660()
11、and RCC6666()注:数值为平均值标准差,n=3 54 海洋科学/2022 年/第 46 卷/第 12 期 2.4 对颗石藻色素含量的影响对颗石藻色素含量的影响 2.4.1 不同铁浓度对叶绿素不同铁浓度对叶绿素 a 的影响的影响 不同铁浓度对颗石藻叶绿素 a 的含量的影响不大,各个实验组之间不具有显著性差异(见图 4a)。两者比较,在较低铁浓度(0、50、100、500 nmol/L)下,株细胞中的含量更高,而 株在 1 000 nmol/L 时的叶绿素 a 含量更高。2.4.2 不同铁浓度对叶绿素不同铁浓度对叶绿素 c 的影响的影响 如图 4b 所示,在 0、50 和 100 nmo
12、l/L 时,株的叶绿素 c 含量高于 株,而在 500 和 1 000 nmol/L 时,株的叶绿素 c 含量显著低于 株(P0.05)。且 株在1 000 nmol/L 时的叶绿素 c 含量显著高于 50 nmol/L(P0.05)。2.4.3 不同铁浓度对类胡萝卜素的影响不同铁浓度对类胡萝卜素的影响 如图 4c 所示,在 0、50 和 100 nmol/L 时,株的类胡萝卜素含量高于 株,而在 500 和 1 000 nmol/L时,株的类胡萝卜素含量低于 株,与叶绿素 c 含量变化一致,且在 1 000 nmol/L 时存在显著性差异(P0.05)。株在 100 nmol/L 铁浓度时的
13、类胡萝卜素含量显著高于 500 nmol/L 和 1 000 nmol/L(P0.05)。株在 0 和 50 nmol/L 时的类胡萝卜素含量显著低于其他浓度的含量(P0.05)。图 4 五种实验铁浓度对 RCC6660()和 RCC6666()中的叶绿素 a、叶绿素 c 及类胡萝卜素的影响 Fig.4 Effects of five experimental iron concentrations on chlorophyll a,chlorophyll c,and carotenoids of RCC6660()and RCC6666()注:数值为平均值标准差,n=3。不同字母表示单一藻株
14、不同铁浓度之间具有显著性差异(P0.05),柱状图上的横线表示两个藻株之间有显著性差异(P0.05)。但是在铁浓度0 nmol/L 的培养基中培养的细胞竟然消耗了比高浓度铁环境中更多的磷。株比 株在同样的条件下消耗的磷多。根据氮盐的剩余浓度可知,硝酸盐的消耗呈现先增后减再增的状态。Marine Sciences/Vol.46,No.12/2022 55 表 1 五种实验铁浓度对 RCC6660()和 RCC6666()的氮磷消耗的影响 Tab.1 Effects of five experimental iron concentrations on nitrogen and phosphoru
15、s consumption by RCC6660()and RCC6666()藻株 铁浓度/(nmolL1)34PO-浓度/(gL1)4NH+浓度/(gL1)2NO-浓度/(gL1)3NO-浓度/(gL1)0 56.5011.94 15.903.31 0.210.16 50.7219.34 50 76.8121.47 23.7324.53 0.180.14 46.3312.91 100 69.6210.25 5.410.28 0.420.13 50.584.31 500 68.4326.60 6.360.76 0.140.12 39.6721.75 RCC6660 1 000 62.2811.
16、97 10.562.82 0.340.35 34.259.22 0 90.508.76 29.7517.41 0.290.09 64.6331.65 50 104.0110.19 10.767.02 0.390.21 55.9219.72 100 100.1616.32 11.517.28 0.020.03 59.0114.19 500 92.158.63 13.009.97 0.580.16 53.716.27 RCC6666 1 000 85.543.91 11.101.67 2.543.93 51.3514.80 注:数据为实验结束后培养基中的氮(稀释 50 倍)与磷(稀释 2 倍)含量,起始值相同。表中数据为三次重复的平均值标准差,n=3 2.6 对颗石藻光合作用的影响对颗石藻光合作用的影响 不同铁浓度条件下培养的 株藻细胞 PSII 活性没有显著性差异,但是 株在铁浓度为 100 nmol/L时的活性显著低于 500 nmol/L 时(P0.05)。而且在铁限制条件(0 nmol/L)下,株的 Fv/Fm显著低于 株(P0.05)(图 5a)。图 5 五种实验铁浓度对 RCC
