1、项目名称：新功能人造生物器件的构建与集成首席科学家：赵国屏 中国科学院上海生命科学研究院起止年限：2012.1-2016.8依托部门：中国科学院一、关键科学问题及研究内容合成生物学的基点是：基于工程化策略，采用标准化生物元件，构建通用型生物学模块，在有目的设计思想指导下，组装具有特定新功能的人工生命系统。相比其它工程领域（如电子工程）的研究对象，生命体系是高度动态、灵活调控、非线性、且不可预测的。如此复杂的体系如何以工程化的设计，获得特定的人工生物器件或生命系统，是合成生物学研究面临的核心科学问题。围绕着这一重大科学问题，本项目拟在生物元件、模块、途径、网络等层次上解决设计、合成、组装、调试等
2、问题，即（1）生物功能器件（元件和模块）的设计原理；（2）生物功能器件的人工合成与标准化；（3）生物功能器件的适配机制。1、拟解决的关键科学问题1）生物功能器件的设计原理提高对功能模块和元件的设计能力，是实现化合物生物合成途径组装的前提。生物的代谢多样性（特别是微生物和植物），决定了它们具有非常强大的合成各种初级和次生代谢产物的能力。然而，自然界中任何一种生物拥有的酶系种类和催化效率均有限，一般不能满足生产的需要。因此，根据目标化合物的结构特征，确定相应的生化反应类型，利用自然代谢的多样性，从基因组数据库中寻找、解耦、抽提相关的元件和相应的功能模块；基于对元件的功能表征，将相关代谢途径模块化，
3、利用数学模型模拟计算不同元件组合后的功能输出，设计并优化生物合成途径，在底盘细胞上组装，有可能提高构建复杂代谢途径的效率，实现人造生物功能组合合成的工程化。同时，分析元件与功能模块的分子基础，包括物种的密码偏好性，将有利于理解自然元件进化的本质，指导元件与模块以功能优化为目的的人工进化。2）生物功能器件的人工合成与标准化生物功能元件是合成生物学研究的基石。编码酶蛋白的结构基因是代谢途径的基本结构元件，其序列决定了所编码蛋白的一级结构和催化效率。DNA结构元件在宿主细胞中的表达程度和活性受到调控元件的控制，它们共同组成了可催化某一步特定生化反应的简单功能模块。目前，用于合成生物学研究的元件库容有
4、限，对它们的理解和功能表征不够；许多天然元件往往需要在改造后才能用于合成生物学研究。同时，高通量、低成本、高保真的DNA合成技术尚未建立，还不能大规模地人工合成新功能元件。发掘自然代谢的多样性，分析基因与蛋白等生物元件的结构、功能、调控以及分子进化特征，在现有生物学和基因组知识的指导下人工设计合成各种新功能元件，对各类元件进行工程性的定量的功能表征，建立代谢功能和调控功能明确的元件库和模块库，建立标准化的元件组装技术。为我国合成生物学发展提供实用的生物元件库，建立基于标准生物元件的合成代谢途径的技术体系，实现人造生物功能的组装合成。3）生物功能器件的适配机制合成生物学的目标是组装一系列具有特定
5、代谢功能的分子模块，并赋予其整体功能。然而，人们对活细胞工作原理的了解还远远没有达到对电子机械设备工作原理所了解的程度，直接对自然界的器件进行组装常常不能按预期模式互相耦合，导致人工生物合成路线发生故障。同时，导入的生物合成功能模块往往会对底盘细胞造成很大的影响，甚至会抑制细胞的生长，也使得生物合成途径不能有效地工作。元件与元件之间、元件与模块之间、功能模块之间、以及功能模块和底盘细胞之间的适配程度，决定了生物合成途径的整体效率。建立高通量的检测与调试平台，对器件之间的组合在底盘细胞上进行高通量的测试，在此基础上认识并且优化器件之间的适配性。从基因、蛋白、网络、细胞的层面上理解各种模块组合对底
6、盘细胞的影响，可以指导人工生物系统的组装优化。在基因组规模上分析人工细胞生物合成能力对遗传和环境扰动的响应，将有利于揭示人工细胞功能进化的遗传机理，深入理解化学品生物合成的调控机制，实现在底盘细胞上模块之间的优化磨合对接，极大地提升合成人工细胞的能动性和精确度。2、主要研究内容针对生物功能器件设计原理的科学问题（1），本项目研究将集中于通过整合各种组学数据，建立大肠杆菌、链霉菌和酵母等底盘细胞的代谢网络和调控网络模型，指导模块的设计合成以及人工细胞改造。分析基因组信息和生化反应数据信息，设计目标化合物合成途径。将设计的合成途径与底盘细胞网络模型虚拟整合，分析两者代谢的相容性，鉴定出目标化合物合
7、成最优路线，并模拟预测网络中的重要途径及关键分支节点，提出人工细胞系统优化的策略以实现目标化合物合成途径的流量最大化。分析代谢途径网络的连通结构，建立功能模块的解耦方法，为目标化合物合成途径的组装提供设计方案。对生物元件进行数学建模，模拟计算不同元件组合后的功能输出，实现模型指导的功能模块的设计。针对生物功能器件人工合成与标准化的科学问题（2），本项目研究将集中于发展规模化的生物元件发掘、合成、工程性鉴定表征、以及标准化的技术与工程平台。发掘天然元件的多样性，尤其是目标化合物合成途径中的催化元件。研究基于微流芯片的寡聚核苷酸片段高通量并行合成技术，改造开发低成本、高保真的中通量DNA合成技术以
8、及大片段DNA高效保真的体外和体内的拼接技术，高效精确地合成目标DNA元件。发展密码子优化技术，提高异源结构元件在底盘细胞中的表达强度。结合蛋白理性设计和定向进化技术，提高结构元件催化相关生化反应的活性。在元件功能表征的基础上，构建催化各类通用生化反应或特殊反应的结构元件库。同时构建大肠杆菌、链霉菌和酵母等底盘细胞的启动子、核糖体结合位点、非编码RNA、及合成蛋白骨架等调控元件库，并对其进行工程表征，精确定量调控强度。建立标准化的元件接口和串联组装技术，高效组装具有特定功能的受调控的分子模块，组装聚酮类、萜类等化合物生物合成途径。发展底盘细胞的高效同源重组技术，提高功能模块的组装效率。针对生物
9、功能器件适配机制的科学问题（3），本项目的研究将集中于建立高通量的底盘细胞改造平台以及元件组合和模块集成适配性检测平台，实现in silico、in vitro和in vivo进化优化技术的统一。利用代谢控制分析技术揭示目标化合物生物合成途径中代谢流的关键动力学节点与限速步骤。研究重要中间产物等对目标化合物合成途径的调控作用，研究终产物或中间产物对关键催化元件的反馈抑制或反馈阻遏机理，进行相关催化元件的分子进化改造。采用定量表征的启动子、核糖体结合位点和非编码RNA元件、以及合成蛋白骨架技术，对功能模块中的催化元件进行精确调控，以优化模块之间的适配性、解除途径的限速步骤，使人工细胞合成目标化合
10、物的代谢通量达到最大化。通过多重基因组自动改造技术，在多基因水平对功能模块之间的适配性进行进一步的优化，实现高效生物合成途径的创建。发展大肠杆菌和链霉菌的新型高效遗传操作技术，对宿主细胞的代谢途径网络进行高通量的改造，重新分配其物质流、能量流，提高人工细胞合成目标产品的生产能力。采用转录组、蛋白质组、代谢物组、代谢流量组等组学分析技术，分析生物合成途径的导入对宿主细胞的影响，鉴定出人工细胞生产能力提高的遗传机制，优化其目标化合物的合成能力。二、预期目标1. 总体目标实现人造生物器件构建及集成关键科学和技术问题的重大突破，建立大片段DNA高效合成拼接技术体系，建立生物元件合成与表征、模块设计与集
11、成、系统组装与调试等工程平台，建立代谢和调控功能明确的标准化元件库和通用型模块库；在此基础上，探索萜类和聚酮类等重要天然产物的新生物合成路线，在埃博霉素、紫杉醇、人参皂苷等天然药物的生物合成方面形成优势和特色。培养和造就一批青年学科带头人和学术骨干，促进我国合成生物学快速成长和长远发展。2五年目标1）突破生物器件人工合成组装与标准化的技术瓶颈，建立人造生物器件及集成的关键技术：建立高通量高保真大片段DNA合成拼接技术体系，发展规模化的生物元件发掘、合成、工程性鉴定表征、以及标准化的技术与工程平台；建立代谢网络模拟和化合物合成途径设计平台；建立高通量的元件组合和模块集成的适配性检测平台、以及底盘
12、细胞的改造平台。2）阐明生物功能器件（元件和模块）的设计原理，建立标准化的生物元件库：完成30-40个化学品合成相关的基因元件的发掘、合成和功能表征；构建3-4种大肠杆菌、链霉菌和酵母的工程性鉴定过的调控元件库；设置DNA元件的标准接口，相应建立生物元件及功能模块的标准化组装技术；构建标准化、高通用性的新载体及染色体改造系统，规模化整理和文档化生物元件库。3）探索生物功能器件的调试及适配机制，实现重要天然化合物的异源合成并提高产量：构建10-15个天然化合物合成相关的功能模块；创建若干重要天然药物的新生物合成路线，实现其在底盘细胞内异源合成，实现相关功能模块的精确调控与适配，显著提高人工细胞的
13、生产能力。4）发表SCI论文100篇, IF10的文章3-5篇。申请发明专利25-30项。5）培养80-100名博士研究生，30名左右技术骨干，20名左右学术骨干；组织3-5次国际合成生物学学术会议，形成一支在国际合成生物学领域得到同行认可、有重要影响力的研究团队。三、研究方案1、总体研究思路、项目研究的技术路线及可行性本项目的总体研究思路：针对合成生物学“模块化、工程化”构建人工生物系统的目标，本项目拟采取自上而下的设计方式，即从分析基因组、代谢网络构建模拟出发，计算和设计目标化合物合成的最优途径，进而进行合成途径上相关功能模块的解析、解耦、抽提，指导相关结构元件和调控元件的组装。另一方面，
14、人工细胞的合成采取自下而上的构建方式，即发掘、改造、或人工合成各种生物元件，将不同的结构元件和调控元件组装成具有特定功能的模块，集成相关功能模块、组建目标化合物的合成途径。在生物器件、途径、网络等各个层次上采取设计-合成-调试- 图1 本项目的学术思路再设计的循环方式，即对设计、构建出的生物器件进行定量的、工程性的表征分析，指导新一轮的设计；对模块集成进行功能测试，从而指导设计模块组装、精确调控相关模块，不断优化模块适配性；对构建出的人工细胞进行代谢组、流量组、转录组等各种组学分析，加入到代谢网络模型中，通过模拟计算提出进一步系统优化的策略。这样通过结合自上而下的设计与自下而上的构建，探索人工
15、合成生物体的器件组装及调控的基本原理与普适性规律，实现目标化学品生物合成新途径的创建（图1）。为了实现人造生物器件及集成的功能测试和优化，本项目将研究萜类和聚酮类代表性化合物（埃博霉素、紫杉醇、人参皂苷）的合成途径在底盘微生物中的重组创建。作为天然产物中最大的两类，萜类和聚酮类化合物在生物医药研究和产业中具有非常重要的地位。对这两类化合物的研究不仅对基础研究，同时将有助于推动我国相关行业的技术进步。聚酮类化合物埃博霉素和萜类化合物紫杉醇、人参皂甙都是具有独特药理活性的化合物，临床需求巨大。这些化合物来源于生长缓慢、难以大规模培养的微生物宿主（如埃博霉素来源于粘细菌）或珍稀植物宿主（如紫杉醇来源
16、于红豆杉、人参皂甙来自于人参），通过合成生物学方法获得具有明显的优势。本研究拟通过合成生物学的方法开发获得这些化合物的新途径。本项目研究的技术路线：结合设计、合成与分析，实现两大类天然产物的合成途径在底盘细胞上的组装和高效运作。图2本项目拟采取的技术途径具体而言，利用比较基因组学方法分析基因组序列，结合生化反应数据，设计目标化学品的各种潜在合成途径。利用生物信息学和计算生物学技术整合各种组学数据，建立底盘细胞的代谢网络和调控网络模型，将设计的目标产品合成途径整合到底盘细胞的网络模型中，计算各条生物合成路线的能量供给、还原力平衡、以及产物的理论产率，从而设计出目标化合物合成的最优路线，同时模拟预
17、测网络中的重要途径及关键分支节点，提出人工细胞系统优化的策略。用图论方法对代谢途径网络的结构进行分析，建立功能模块的解耦方法。通过数学建模，模拟计算不同元件组合后的功能输出，指导基因回路和功能模块的设计。此外，通过密码子优化技术对异源结构元件的DNA序列进行设计，提高其在宿主细胞中的表达强度。发展高通量高保真的DNA合成技术，合成催化关键生化反应的各种来源的DNA结构元件以及启动子、核糖体结合位点、非编码RNA等调控元件。利用酶的定向进化技术，结合高通量筛选技术，提升结构元件催化目标生化反应的能力。发展能够快速高效地将小片段DNA拼接成大片段DNA的关键技术，从而将不同的结构元件和调控元件组装
18、成具有特定功能的模块。建立标准化组装技术和高效同源重组技术，使不同元件的组装模式化、标准化。通过合成蛋白骨架技术，将不同的功能模块按照程序设计好的模式排列在蛋白骨架上，从而精确调控功能模块的相互作用。通过多重基因组自动改造技术，在多基因水平对功能模块进行调控。通过进化代谢技术、转座子突变技术和全局转录机器改造技术，系统优化人工细胞的性能。利用稳定同位素标记结合核磁共振分析、或质谱分析的高通量代谢流量组学分析技术、分离和结构鉴定相结合的代谢组学分析技术，以及转录组学、蛋白质组学分析技术，鉴定出人工细胞功能进化的分子机理，为代谢网络模型提供数据支撑。利用代谢控制分析技术，揭示途径中代谢流的关键动力
19、学节点与限速步骤，为途径上功能模块组装的优化设计提供理论依据。可行性分析：1）高水平的研究队伍和良好的研究基础：本项目汇集了我国微生物学、基因组学、生物信息学、计算生物学、化学、化学生物学、生物化学与分子生物学、蛋白质工程、代谢工程等相关学科做出突出成绩的中青年科学家，学术实力雄厚、学科交叉性强，是确保项目顺利实施和取得重大突破的最重要及最基本的要素。本项目提出的主要科学技术问题均有较好的研究基础，例如代谢和调控网络构建、基因组功能元件挖掘和元件库的构建、DNA合成和大片段拼接、生物合成途径的重构、系统的分析与调试等方面都有了相当多工作积累，在某些方面的研究水平居于国际前列。各课题组的前期研究
20、不但积累了大量的功能基因，优化了针对底盘微生物的遗传操作体系，建立了各种新技术和新方法的原型，而且各课题组在多方向、多途径摸索过程中建立了有针对性的研究方向，为本项目的实施和完成奠定了良好的基础。 2）科学合理的研究思路：本项目基于我国在相关学科的良好研究基础之上，面对合成生物学中模块获取、标准化、优化、组装中的一系列重要科学问题，有针对性的开发新技术与方法。本项目充分考虑到了课题设置的逻辑性和关键技术环节，提出了合理的应对方案，并且对关键技术均有较为充分的前期研究。提出的技术路线和实验方案是在长期工作积累的基础上提出的，是合理和可行的。 3）优良的研究条件：本项目汇集了国内相关领域的主要优势
21、单位，研究队伍的主体包括了我国著名高校与中科院系统的研究机构。本项目依托上海生命科学院合成生物学重点实验室，具有承担国家重大研究项目的先进的研究设施和良好的工作条件。4）有效的管理模式：本项目实行首席负责者，同时在项目筹备和实施过程中将在资深专家学者组成的顾问委员会指导下进行。专家顾问将定期对项目的进展进行指导，并根据国内及国际研究形式的变化给出前瞻性建议，这为项目的顺利完成提供了有力的保证。2. 创新点（1）新思路：从下而上、基于标准化元件组装代谢途径过去20年内国际上开展的代谢工程研究，大多是对细胞原有途径进行改造、或将需要的功能元件导入到宿主细胞中，由于对所用元件缺乏表征、以及对元件之间
22、的适配性缺乏了解，因此很多代谢工程研究达不到预期目标，往往需要花费大量的时间对各个元件进行改造，才能逐步提高构建途径的效率。本项目通过优选或合成标准化元件，利用标准化的组装技术，从下而上地构建代谢途径。由于使用的元件是经过定量表征化、可反复使用的，所以将大大节省构建复杂代谢途径所花费的时间，提高途径构建的能动性和精确度。（2）新体系：一批重要天然化合物的高效异源合成在对自然基因资源分析的基础上，设计植物或真菌来源的天然化合物的合成途径、及相关功能模块与基因元件，整合DNA合成技术和密码子优化技术提高异源结构元件在底盘细胞上的表达强度，并通过蛋白质工程提高关键结构元件的催化效率；利用定量表征的调
23、控元件对功能模块进行精确调控，修饰、替换和优化合成代谢网络，从而创建萜类化合物、聚酮类化合物等天然化合物在底盘细胞上的高效异源合成，开创天然化合物生产的新模式，获得一批重要天然化合物的人工生物合成。3. 课题设置课题1：基因组网络分析与功能模块设计主要研究内容：1）代谢网络的模拟建立基因组尺度的代谢网络模型，形成可以计算的电子虚拟细胞，实现对不同环境下细胞代谢与调控的模拟计算能力和仿真预测能力。建立代谢网络的解耦方法，辨识网络中的重要途径及关键分支节点。2）化学品生物合成途径的设计根据目标化合物的结构特征，在基因组序列分析基础上寻找具有相应催化功能的酶，设计目标化合物的合成途径。3）功能模块和
24、元件的设计解析和解耦目标化合物合成途径上的相关功能模块。通过非稳态代谢流量分析和代谢控制分析，揭示合成途径中代谢流量的关键动力学节点与限速步骤，优化设计功能模块中的催化元件和调控元件。研究目标：1) 完成2-3种底盘细胞的实际代谢网络和代谢模型的构建；2) 设计出埃博霉素、紫杉醇、人参皂苷等化合物合成的最优途径；3) 获得2-3个独立功能模块的数学模型。4) 在SCI期刊上发表论文约25篇，申请专利5-8项，培养8-10名博士研究生，20名硕士研究生。承担单位： 中国科学院青岛生物能源与过程研究所、天津大学、南开大学、中国科学院北京基因组所、中国科学院上海生命科学研究院、华东理工大学课题负责人
25、： 徐健学术骨干： 张卫文、冯露、胡松年、杨琛、花强经费比例： 20%课题2：基因与基因组的精细合成原理和技术主要研究内容：1）高通量、高保真、高效率DNA化学合成技术的建立发展高通量、高保真和低成本的DNA合成技术。2）大片段DNA拼接和高效转化技术的建立建立高效率、高保真的DNA片段的体外和体内拼接技术和转化技术。发展大片段DNA在不同宿主中的高效转化（或转导）技术。3）发展底盘细胞的新型遗传操作技术发展大肠杆菌、链霉菌和酵母的新型高效遗传操作技术，提高底盘细胞的遗传操作效率和功能模块的组装效率。研究目标：1) 建立高通量高保真的DNA合成技术2) 建立高效率的大片段DNA拼接技术和转化技
26、术。3) 建立4-5种大肠杆菌、链霉菌和酵母的新型高效遗传操作技术。4) 在SCI期刊上发表论文约10篇，申请专利10-12项，培养8-10名博士研究生，20名硕士研究生。承担单位： 中国科学院上海生命科学研究院、天津工业生物技术研究所、复旦大学、中国科学院武汉病毒研究所课题负责人：赵国屏 学术骨干： 田敬东、Simon Rayner、丁晓明、余军平、钟莉经费比例： 20%课题3：新功能人造生物器件的构建主要研究内容：1）结构元件的发掘、合成及进化改造发展规模化的生物元件发掘技术，发掘萜类和聚酮类化合物合成途径上的元件。发展密码子优化技术，人工合成各种来源的结构元件。发展高效定向进化技术，有效
27、提高关键蛋白催化相关生化反应的活性。2）调控元件的合成及定量鉴定构建底盘微生物的调控元件库，对各种调控元件在底盘细胞内进行多尺度地准确测试，为在转录、转录后、翻译等多种水平上精确调控基因表达奠定基础。3）生物元件的组装及标准化建立DNA元件的标准化串联组装技术，设置它们的标准接口，将不同的结构元件和调控元件组装成具有特定功能的分子模块。建立标准化生物元件库。研究目标：1) 完成30-40个化学品合成相关的基因元件的发掘、合成和功能表征，完成埃博霉素、紫杉醇、人参皂苷等化合物合成途径中关键结构元件的发掘和合成。2) 构建出3-4种定量鉴定的调控元件库，为功能模块的精确调控奠定基础。3) 建立生物
28、元件及功能模块的标准化组装技术。4) 在SCI期刊上发表论文约30篇，申请专利8-10项，培养8-10名博士研究生，20名硕士研究生。承担单位： 中国科学院上海生命科学研究院、中国科学院大连化学物理研究所、华东理工大学、中国科学院微生物研究所 课题负责人： 周志华 学术骨干： 张毅、赵宗保、王学东、牛国清、芦银华经费比例： 20% 课题4、功能模块的集成与测试主要研究内容：1）代谢功能模块库的建立设计、合成萜类和聚酮类天然化合物合成相关的功能模块，形成相互呼应的初级代谢和次级代谢相关的模块群，建立代谢功能明确的模块库。 2）合成代谢功能模块的集成与测试将萜类和聚酮类化合物合成相关的功能模块，在
29、底盘细胞上实现组装，实现埃博霉素、紫杉醇、人参稀有皂苷Rh2等目标化合物的异源合成。利用代谢控制分析技术揭示目标化合物合成途径中代谢流的关键动力学节点与限速步骤。3）目标化学品合成模块的精确调控在电子虚拟细胞的设计指导下，采用定量鉴定的调控元件，对功能模块中的催化元件进行精确调控，调整相关催化元件的表达剂量以解除限速步骤，使合成途径的通量达到最大化。研究目标：1）组装出10-15个天然化合物合成相关的功能模块。2）构建出2-3个天然化合物合成的人工细胞。3）在大肠杆菌、链霉菌或酵母中实现埃博霉素、紫杉醇、人参稀有皂苷Rh2等相关功能模块的精确调控。4）在SCI期刊上发表论文约25篇，申请专利5
30、-8项，培养8-10名博士研究生，20名硕士研究生。承担单位： 中国科学院微生物研究所、中国科学院上海生命科学研究院、南京工业大学、天津工业生物技术研究所、 中国科学院上海有机化学所课题负责人： 刘双江 学术骨干： 王勇、谢婧婧、刘涛、方正、段炼经费比例： 20% 课题5、人工细胞的代谢网络改造与系统优化主要研究内容：1）人工细胞的代谢网络分析以合成目标化合物的人工细胞为对象，利用各种组学技术系统分析引入异源生物合成途径对底盘细胞的影响，揭示目标化合物在人工细胞中进行生物合成的瓶颈，形成人工细胞的设计改造和环境控制策略。2）人工细胞的基因组工程改造在计算机设计的指导下，对底盘细胞的代谢途径网络
31、进行改造，提高目标化学品合成所需的前体代谢物和辅因子的供应，提高人工细胞合成目标化合物的生产能力。3）人工细胞性能的系统优化对人工细胞进行适应性进化，获取稳定的遗传性状。系统提高人工细胞对各种环境胁迫的适应能力，鉴定出人工细胞生产能力和环境适应能力提高的遗传和调控机制。研究目标：1) 形成人工细胞合成埃博霉素、紫杉醇、人参皂苷等化合物的能力，通过in silico和in vivo方法解析出生产能力提高的遗传机理，实现产量在一定程度上显著提高。2) 鉴定出8-10种与人工细胞适应各种环境胁迫相关的抗逆元件，解析出人工细胞环境适应的遗传机理。3) 在SCI期刊上发表论文约20篇，申请专利5-10项
32、，培养8-10名博士研究生，20名硕士研究生。承担单位： 中国科学院上海药物研究所、天津大学、中国科学院微生物研究所、中国科学院上海生命科学研究院、中国科学院广州生物医药与健康研究院 课题负责人： 岳建民 学术骨干： 元英进、陶勇、蒋宇、李平作、刘兴国经费比例： 20% 4. 各课题间的相互关系，以及与项目总体目标和五年目标的关系各课题相互之间的关系如图3所示。各课题通过解决的科学问题实现有机关联，通过各自的研究目标组成了人造生物器件构建与集成的研究循环。课题1为其它课题提供基础理论认识和实验指导，课题2为课题3提供低成本、高保真、高效率的大片段DNA合成技术，课题3为4提供模块集成和途径重建
33、所需的器件，课题4构建的生物合成途径在课题5中得以优化，课题5获得的人工细胞可以作为模型进入下一轮课题1的计算设计，同时也为课题2 提出了DNA合成技术与遗传操作工具的新的要求，直至最后获得高效生产目标化合物的人工细胞。各课题与项目总体目标的关系：这5个课题的研究成果，将建立合成生物学的研究体系和关键工程技术平台，建立标准化通用型的生物器件库，突破重要天然药物异源合成的技术瓶颈，为我国合成生物学的良好发展奠定基础。 各课题与项目五年目标的关系：课题1、3、4、5的研究结果将建立合成生物学的关键工程化平台、实现天然化合物的异源合成，课题2的研究结果将建立合成生物学的核心技术。图3 各课题间相互关
34、系四、年度计划研究内容预期目标第一年进行底盘微生物细胞的代谢网络和调控网络模型的构建。分析基因组序列信息和生化反应数据库信息，设计埃博霉素、紫杉醇等目标化合物的合成途径。发展大肠杆菌、链霉菌和酵母等底盘微生物的新型高效遗传操作技术。发展高效率的DNA片段体外拼接技术技术。发掘自然界基因和酶的多样性，尤其是萜类和聚酮类化合物合成途径上的元件。发展密码子优化技术，分析异源结构元件在宿主细胞中的表达强度。合成底盘微生物的启动子等调控元件，发展对其定量鉴定的方法。设置元件的标准接口，发展DNA元件的标准化串联组装技术。在基因组序列和自然基因元件解析的基础上，设计和合成若干代谢功能模块。在计算机设计的指
35、导下，对大肠杆菌、链霉菌和酵母的代谢途径网络进行改造，提高萜类和聚酮类化合物合成所需的前体代谢物和辅因子的供应，提高细胞合成目标化合物的能力。初步获得1-2种底盘微生物的代谢网络图。完成埃博霉素、紫杉醇前体的合成途径的设计。建立2-3种大肠杆菌、链霉菌和酵母的新型高效遗传操作技术。建立高效率的DNA片段体外拼接技术。发掘、合成5-10个化学品合成相关的基因元件，并对其功能表征。建立对调控元件定量鉴定的方法。建立DNA元件的标准化串联组装技术。设计和组装3-5个代谢功能模块。发表论文20-30篇，申请专利3-5项。第二年利用代谢通量组学和代谢组学分析技术，进行底盘微生物胞内真实代谢网络的构建，对
36、其进行分析与表征。解析人参皂苷的基因组序列信息，结合转录组、代谢组等分析，进行人参皂苷合成途径的解析。发展高通量的DNA合成技术、以及高效率、高保真的DNA片段体内拼接技术。发展大片段DNA在不同宿主中的高效转化（或转导）技术。人工合成各种来源的合成目标化合物所需新引入的结构元件。对组成型、及诱导型启动子、核糖体结合位点等进行多位点突变和改造，构建启动子库和核糖体结合位点库。对各种调控元件在底盘细胞内进行多尺度地准确测试，精确定量调控元件的调控强度。将萜类和聚酮类化合物合成相关的功能模块，在底盘细胞上进行组装和测试。完成人参皂苷的基因组序列信息分析，获得人参皂苷的基因表达谱。建立高通量的DNA
37、合成技术、以及高效率高保真的DNA片段体内拼接技术。建立大片段DNA在不同宿主中的高效转化（或转导）技术、以及2-3种大肠杆菌、链霉菌和酵母的新型高效遗传操作技术。发掘、合成、功能表征5-10个化学品合成相关的基因元件，完成埃博霉素、紫杉醇前体等化合物合成途径中关键结构元件的发掘和合成。构建出底盘细胞的2-3中调控元件库，并对其定量鉴定。设计和组装3-5个天然化合物合成相关的功能模块。构建出2-3个天然化合物合成的人工细胞。发表论文20-30篇，申请专利3-5项。第三年通过整合各种组学数据提高代谢网络模型的预测能力，形成可以计算的电子虚拟细胞。对复杂代谢网络的连通结构进行分析，发展代谢网络的解
38、耦方法，辨识网络中的重要途径及关键分支节点。发展结构元件的高通量表征技术，解析结构元件所编码的蛋白结构，发展高效定向进化技术，有效提高关键蛋白催化相关生化反应的活性。构建催化各类生化反应的结构元件库。针对目标化合物的生物合成途径，发展代谢控制分析方法，解析途径中代谢流的关键动力学节点与限速步骤。以合成埃博霉素、紫杉醇前体的人工细胞为对象，进行不同条件下的转录组、蛋白质组、代谢物组、代谢流量组等组学分析，系统分析引入异源生物合成途径对宿主细胞的影响。完成2-3种底盘细胞的实际代谢网络和代谢模型的构建。建立代谢网络的解耦方法，完成2-3个对天然化合物合成有重大影响的代谢模块分析。完成3-4种关键结
39、构元件催化功能的改造。构建出催化各类生化反应的结构元件库、2-3种定量鉴定的调控元件库。建立目标化合物生物合成的代谢控制分析方法，揭示合成的限速步骤。完成合成埃博霉素、紫杉醇前体的人工细胞的各种组学分析。发表论文20-30篇，申请专利3-5项。第四年基于对各种元件的定量鉴定，对其进行数学建模，模拟计算不同元件组合后的功能输出。构建标准化、高通用性的新载体系统，用于保存和复制生物元件，规模化整理和文档化生物元件。在电子虚拟细胞的设计指导下，采用定量鉴定的调控元件，对功能模块中的催化元件进行精确调控，调整相关催化元件的表达剂量以解除限速步骤、避免中间产物的积累。利用电子虚拟细胞平台进行计算模拟，预
40、测应如何系统修饰人工细胞的遗传背景或调控环境条件，以优化人工细胞的生化网络，使代谢流尽可能向着萜类和聚酮类化合物最大合成的方向流动，形成人工细胞的设计改造和环境控制策略。完成人参皂苷合成途径的设计、以及途径中关键结构元件的发掘和合成。建立元件输入输出的数学建模方法，获得2-3个独立功能模块的数学模型。完成10-15个化学品合成相关的基因元件的发掘、合成和功能表征。组装出3-5个天然化合物合成相关的功能模块。在大肠杆菌、链霉菌或酵母中实现埃博霉素、紫杉醇、人参皂苷等相关功能模块的精确调控。形成人工细胞合成埃博霉素、紫杉醇前体、人参皂苷等化合物的能力，通过in silico和in vivo方法解析
41、出生产能力提高的遗传机理。发表论文20-30篇，申请专利3-5项。第五年通过新型基因组工程技术，在基因组水平上对影响目标产品合成的基因编码序列、启动子结合位点、核糖体结合位点或其他调控区进行多位点突变、修饰、改造和进化，结合高通量筛选的方法，提高人工细胞合成目标产品的效率。对人工细胞进行反复长周期的驯化培养以进行适应性进化，获取稳定的遗传性状。模拟实际生产环境，设定高产物浓度胁迫等环境压力，基于现有全局扰动技术和发展新的全局扰动技术，系统提高人工细胞对各种环境胁迫的适应能力。通过组学分析，鉴定出人工细胞生产能力和环境适应能力提高的遗传和调控机制。基于新的知识进行系统优化，在提高人工细胞的环境适应性的同时，显著提高目标化合物的合成能力。完成合成人参皂苷的人工细胞的各种组学分析。通过人工细胞的基因组工程改造，实现埃博霉素、紫杉醇前体、人参皂苷的产量在一定程度上显著提高。鉴定出8-10种与人工细胞适应各种环境胁迫相关的抗逆元件，解析出人工细胞环境适应的遗传机理。发表论文20-30篇，申请专利3-5项。
