1、 国家自然科学基金申请书学科代码：C1606 受理部门： 收件日期：受理编号：第 16 页 共 16 页国家自然科学基金申 请 书您现在还不能填写文档或打印，请根据以下三个步骤操作： 1)如果您是Word2000或以上版本用户，请把Word宏的安全性设为:中 方法: Word菜单-工具-宏-安全性-安全级,设置为中 (如果您是Word97用户，继续执行以下步骤) 2)关闭本文档，重新打开本文档 3)点击启用宏按钮，即可开始填写本文档或打印了资助类别：面上项目亚类说明：青年科学基金项目 附注说明：项目名称：以PSCA为启动因子重组腺病毒转染纳碘泵基因治疗前列腺癌申 请 者： 电话： 依托单位：中
2、国人民解放军第二军医大学通讯地址： 邮政编码： 单位电话：021-25070230E-mail ： 申报日期： 2003年3月15日国家自然科学基金委员会基本信息申 请 者 信 息姓名性别 出生年月 年 月民族 学位 职称 主要研究领域 电话 E-mail 传真 个人网页 工作单位 在研项目批准号 依托单位信息名称代 码20043303 联系人陆伟 E-mailLWYYOK 电话021-25070230 网站地址 合作单位信息单 位 名 称代 码 项 目 基 本 信 息项目名称资助类别面上项目 亚类说明青年科学基金项目 附注说明 学科代码C1606:泌尿外科学 C1710:肿瘤学 基地类别 预
3、计研究年限2004年1月 2006年12月研究属性应用基础研究 总预算经费 申请经费 摘 要项目研究内容和意义简介（限400字）：我国前列腺癌发病率近年来呈明显上升趋势，但初诊时50以上已有转移，内分泌治疗是其最主要、有效的姑息性疗法。但几乎所有病人将转为激素非依赖性，即对内分泌治疗不再敏感，成为治疗的一大难题。本课题应用腺病毒载体将白介素2（IL2）和钠/碘转运蛋白基因转染前列腺癌小鼠模型的癌组织内，使目的基因在前列腺癌组织内特异性表达。然后给予碘放射性同位素，在钠/碘转运蛋白的作用下，同位素碘在前列腺癌组织内高浓度聚集，以达到杀伤肿瘤细胞的作用。而IL2的表达，可以调节机体的抗肿瘤免疫，在
4、放射性同位素破坏肿瘤细胞、瘤细胞抗原显露后，进一步通过细胞免疫杀伤肿瘤，从而起到抗癌的协同作用。该课题通过腺病毒转染，在组织特异性启动子作用下，目的基因在前列腺癌细胞中特异性表达，从而达到组织特异性杀伤肿瘤组织，尽可能的减少了全身副作用。免疫调节治疗和同位素放疗的有机结合，为中晚期前列腺癌的治疗开辟一条新的途径。关 键 词(用分号分开，最多5个)前列腺癌 钠/碘转运蛋白 放射性碘 白介素2 基因治疗 项目组主要成员编号姓 名出生年月性别职 称学 位单位名称电话E-mail项目分工每年工作时间（月）12345678910总人数高级中级初级博士后博士生硕士生16152062说明: 1. 高级、中级
5、、初级、博士后、博士生、硕士生人员数由申请者负责填报，总人数自动生成。说明: 2. 第一人必须是申请者，信息从前面自动读入。经费预算 (单位:万元) 科 目预算金额备注（计算依据与说明）一研究经费20.0000 1科研业务费1.0000 （1）测试/计算/分析费0.2000统计分析费0。2万（2）能源/动力费0.0000（3）会议费/差旅费0.5000国内学术会议0。5万（4）出版物/文献/信息传播事务费0.3000文献查询0。05万，文章发表费0。25万（5）其他0.00002实验材料费18.0000（1）原材料/试剂/药品购置费15.0000小鼠、饲料及培养剂费2万；目的基因载体的构建、鉴
6、定费8万；放射性同位素2万；各种酶、标准物及其他试剂3万（2）其他3.0000光镜、电镜检查费，ECT检查费2 万；克隆hNIS、测序验证费1万3仪器设备费0.0000（1）购置0.0000 （2）试制0.00004实验室改装费0.00005协作费0.00006其他0.0000二国际合作与交流费0.0000 1项目组成员出国合作交流0.00002境外专家来华合作交流0.0000三劳务费0.0000四管理费1.0000五其他0.0000 经 费 总 预 算20.0000 申 请 经 费20.0000 其他经费来源（单位：万元）自然科学基金其他项目资助经费 0.0000国家其他计划资助经费 0.0
7、000其他经费资助（含部门匹配） 0.0000合 计0.0000 国家自然科学基金项目申请书报告正文（一）立项依据与研究内容（4000-8000字）： 1、 项目的立项依据（附主要的参考文献目录）。 前列腺癌是欧美国最常见的恶性肿瘤。在美国男性肿瘤患者中，死于前列腺癌者高居第二位。前列腺癌发病率的种属差异性非常明显，我国前列腺癌发病率与欧美国家相比较低，但近年来也呈明显上升趋势，由50年代的0.2/10万人口升至90年代的1.2-3.4/10万。前列腺癌的特点是早期很难发现，我国前列腺癌患者初诊时50以上已有转移。对于超过B2期肿瘤（系肿瘤侵犯前列腺组织以外或有远处转移）患者，失去了手术根治的
8、机会，以内分泌治疗为主。内分泌疗法是其最主要、有效的姑息性疗法，但几乎所有病人将转为激素非依赖前列腺癌，且一旦转为激素非依赖前列腺癌，即对内分泌治疗不再敏感，仅能试用化疗，但化疗并不能延长病人生存期。因此，对于雄激素非依赖性前列腺癌的治疗成为前列腺癌诊治过程中亟待解决的问题。前列腺干细胞抗原（PSCA）是Reiter等于1998年用特征性差异分析的方法在人前列腺癌动物模型LAPC-4鼠中发现的一个前列腺癌相关肿瘤抗原3。因为它与干细胞抗原2（stem cell antigen 2,SCA-2）30同源而被命名为前列腺干细胞抗原。同SCA-2一样，PSCA通过GPI共价键锚定在细胞膜上，而不呈分
9、泌形式，但这种共价键可以被GPI特异性的磷脂酶(PIPLC)所断裂。PSCA基因定位于染色体8q24.2，其cDNA的开放读框为372bp，编码123个氨基酸。PSCA具有以下几个特点：（1）在前列腺的组织分布特异性高 6。(2)在大多数的前列腺癌标本中均有表达，而且在激素依赖和激素非依赖前列腺癌中同样高表达6。（3）PSCA通过GPI共价键锚定在细胞膜上，而不呈分泌形式 7、8。而其他的前列腺相关蛋白，如前列腺特异性抗原（PSA）、前列腺特异性膜抗原（PSMA）、前列腺酸性磷酸酶（PAP）、前列腺分泌蛋白94(PSP94)、前列腺癌肿瘤抗原1等，均有各自的不足。它们或为分泌型蛋白，外周血浓度
10、很高，容易诱导免疫耐受；或因其组织分布特异性不强，用来做免疫治疗的疫苗容易引起自身免疫性疾病。因此，PSCA是一个很有前景的前列腺癌基因治疗的特异性的启动子，有望成为局灶性和转移性前列腺癌治疗的新方向11。放射性同位素在治疗甲状腺癌的过程中取得了极大的成功，即使是有远处转移的进展性甲状腺癌，使用放射性碘治疗也能取得很好的疗效，10年存活期80。【1】正常和恶性的甲状腺细胞摄取同位素的能力差异是由于钠碘转运蛋白（sodium iodide symporter NIS） 的表达水平不一样。甲状腺癌细胞膜上NIS表达水平较高，可以摄取高浓度的131I，使得甲状腺癌得到组织特异性较高的放疗，对全身其它
11、组织器官影响很小。NIS已经被确认为甲状腺腺上皮膜上的一种糖蛋白，具有13个跨膜区，可以特异性的将碘转入细胞内，使得细胞内碘的浓度较血浆增高2040倍。该基因近年来已经被克隆和鉴定。【2】NIS基因的克隆鉴定为肿瘤基因治疗提供了一种全新的治疗手段，将该基因转入非甲状腺起源的肿瘤细胞内，可使131I的摄取明显增加，从而产生类似与甲状腺癌组织特异性放疗的效果。近来有研究报道使用PSA启动子引导NIS基因转染前列腺癌细胞后，可以使放射性同位素在前列腺癌组织中特异性地聚集，获得足够的放射性剂量对前列腺癌细胞产生杀伤作用，大大增强了前列腺癌的放疗强度。实验证明体外细胞培养条件下，PSA-NIS基因转染前
12、列腺癌细胞后，可以完全抑制肿瘤细胞的生长，而裸鼠前列腺癌模型在接受局部注射PSA-NIS基因表达载体后，肿瘤摄取131I的比例为总量2530，肿瘤的生长得到有效的抑制。【3】但是该治疗途径也存在组织内基因表达短暂，131I在组织内生物半衰期短等不足之处难以克服，需要进一步改进以增强其治疗效果。 本课题将以上两种方法相结合，通过基因转染的方式，先使放射性同位素131I在前列腺癌组织中特异性地聚集，获得足够的放射性剂量对前列腺癌细胞产生杀伤作用 。在肿瘤细胞坏死，肿瘤特异性抗原暴露后，进一步通过IL-2调节免疫系统，诱导肿瘤抗原特异性的CD8+ CT活化，并增强其对肿瘤细胞的杀伤作用，从而起到协同
13、抗癌作用。本研究旨在对中晚期前列腺癌的基因治疗方面做一些探索性的工作。 主要参考文献1：Mazzaferri, E.L . Carcinoma of follicular epithelium:radioiodine and other treatments and outcomes . In . L.E. Bravetman and R.D.Utiger(eds), The Thyroid: A Fundamental and Clinical Text , PP . 922-945. Philadelphia: Lippincott-Raven , 1996.2: Spitzweg, C
14、. Heufelder, A.E. and Morris, J.C. Thyroid iodine transport . Thyroid , 10:321-330,20003: Christine , S . Michael, K.O . Elizabeth R . Treatment of prostate cancer by radioiodine therapy after tissue-specific expression of the sodium ildide symporter. Cancer research , 60:6526-6530, 20004: Henny, C.
15、S . Kuribayashi, K . Kern, D.E . Interleukin-2 augments natural killer cell activity . Nature(Lond),291:335-338,19815: Rosenberg, S.A . Lotze, M.T. Muul, L.M . A progress report on the treatment of 157 patients with advanced cancer using lymphokine-activated killer cells and interleukin-2 or high-do
16、se interleukin-2 alone. N.Engl.J.Med , 316:889-897, 19876: Daqing L . Wen J . Jeffery S . Combination surgery and nonviral interleukin 2 gene therapy for head and neck cancer . Clinical Cancer Research . 5: 1551-1556, 1999.2、 项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键问题。 研究内容 本实验研究应用重组腺病毒载体将钠/碘转运蛋白基因转染小鼠前列腺癌细胞，使目的基因在前列腺
17、癌组织内特异性表达，在前列腺癌细胞膜上形成钠/碘转运蛋白。然后给予放射性同位素131I，在钠/碘转运蛋白的作用下，放射性碘在前列腺癌组织细胞内高浓度聚集，以达到杀伤肿瘤细胞的作用。为了最大限度地发挥放射性碘在肿瘤组织内的细胞杀伤力，尽可能地减小在肿瘤以外组织的副作用，我们选用了前列腺癌组织特异性的前列腺干细胞抗原作为启动子，将钠/碘转运蛋白基因基因特异性的靶向前列腺癌细胞；同时，前列腺干细胞抗原不受雄激素的调节，因此，不论是雄激素依赖性还是激素非依赖性前列腺癌，其均能顺利完成钠/碘转运蛋白基因的转移。通过免疫组化的方式鉴定目的基因在肿瘤组织中的表达情况；测定放射性碘在前列腺癌组织中的聚集浓度；
18、测量治疗前后的肿瘤体积；观察治疗后肿瘤组织在光镜和电镜下的病理改变情况；通过ECT了解治疗后的远处转移灶情况。具体研究内容如下：(1)、克隆PSCA和hNIS基因后, 构建重组PSCA-NIS腺病毒载体;(2)、测定在组织特异性PSCA启动子靶向导引下，体外培养前列腺癌细胞株LNCaP细胞和DU145细胞的NIS的表达率;(3)、测定体外培养前列腺癌细胞株LNCaP细胞和DU145细胞的NIS对131I的摄取率及两株细胞的存活率(4)、建立激素依赖性原位及转移前列腺癌动物模型，建立激素非依赖性原位及转移前列腺癌动物模型，建立由激素依赖性转为激素非依赖性前列腺癌的动物模型。(5)、 测定重组PS
19、CA-NIS腺病毒载体转染后，放射性碘对三种前列腺癌动物模型的局部和全身治疗作用。研究目标1、建立构建重组PSCA-NIS腺病毒载体的方法。2、建立三种前列腺癌的动物模型。3、观察局部和全身途径腺病毒转染效率及治疗的效果，探讨该方法在治疗转移性前列腺癌中的应用价值。4、通过该课题研究建立一套完整的前列腺癌基因治疗模式，包括载体的构建，转染后目的基因表达产物的鉴定，体外、体内治疗效果的判断等等，为以后开展更全面、更深层次的研究打下坚实基础。拟解决的关键问题1、目的基因表达载体的构建2、前列腺癌动物模型的构建及转移病灶的检测3、提高腺病毒的转染率及目的基因的表达效率4、延长放射性同位素在前列腺癌组
20、织中聚留时间5、观察有效杀伤肿瘤细胞所需射线强度3、拟采取的研究方案及可行性分析。31、研究方案 ：构建目的基因载体，鉴定目的基因前列腺癌细胞系PC-3 人甲状腺 NIS cDNA 抽RNA 克隆NIS翻译区 RT-PCR PSCA cDNA 测序验证 克隆PSCA翻译区 测序验证 构建重组PSCA-NIS腺病毒载体和对照腺病毒载体(PSCA、NIS) 扩增，纯化，测定病毒滴度 ：观察体外转染、表达效率及体外131I对肿瘤细胞的杀伤能力LNCaP细胞、DU145细胞体外培养 转染重组PSCA-NIS腺病毒载体和对照腺病毒载体(PSCA、NIS)系后培养 免疫组化鉴定NIS基因表达情况 测定转染
21、后细胞摄取131I的能力 测定131I被摄取后对LNCaP细胞、DU145细胞的杀伤能力 ：建立前列腺癌动物模型 、激素依赖性原位及转移前列腺癌动物模型的建立前列腺癌细胞株LNCaP制成单细胞悬液接种裸鼠背部生长成瘤后，移植至前列腺 观察原位前列腺癌的成瘤及转移情况 、激素非依赖性原位及转移前列腺癌动物模型的建立前列腺癌细胞株DU145制成单细胞悬液接种裸鼠背部生长成瘤后，移植至前列腺 观察原位前列腺癌的成瘤及转移情况、由激素依赖性转为激素非依赖性前列腺癌的动物模型的建立传代建立稳定的前列腺癌的异种种植模型去势并行缓退瘤治疗待肿瘤缩小后又增大，血PSA下降后又上升切取瘤体组织移植至去势并服用缓
22、退瘤的裸鼠背部传代建立稳定的激素非依赖性前列腺癌动物模型：局部治疗重组PSCA-NIS腺病毒载体和对照腺病毒载体(PSCA、NIS) 原位前列腺癌动物模型内 注入131I ECT检查，分析其敏感性及特异性 检测肿瘤组织内的细胞免疫功能 观察肿瘤体积变化，分别观察裸鼠的肿瘤重量、成瘤率 瘤内新生血管的分布与数量等指标异性 光镜和电镜观察肿瘤病理改变 ：全身治疗重组PSCA-NIS腺病毒载体和对照腺病毒载体(PSCA、NIS) 静脉注入原位转移前列腺癌激素非依赖性前列腺癌动物模型内 注入131I ECT检查，分析其敏感性及特异性 检测细胞免疫功能 观察肿瘤转移灶体积变化，分别观察裸鼠的肿瘤重量、成
23、瘤率 瘤内新生血管的分布与数量等指标异性 光镜和电镜观察肿瘤病理改变32、可行性分析 、申请者熟练掌握细胞培养、腺病毒载体的构建、RT-PCR, ELISA及免疫组织化学技术； 、前列腺癌动物模型已成功建立； 、申请者具有从事前列腺癌的基础及临床研究经验；所在单位具有常规的分子生物学及细胞生物学仪器，荧光定量RT-PCR仪等先进设备；信息来源快，有助于课题的完成。 、用原位杂交技术对PSCA作了初步的研究，表明在PSCA在前列腺癌细胞中呈高表达4、本项目的特色与创新之处。受放射性同位素成功治疗中晚期甲状腺癌的启发，设计了本实验研究。将钠碘 转运蛋白（NIS）基因通过腺病毒的转染，转运至前列腺癌
24、细胞内，在细胞膜表面表达钠碘泵，选择性地将放射性碘从前列腺癌细胞外转运至细胞内，在细胞内形成高浓度的放射性碘聚集，发射射线，从而杀死癌细胞。本研究选择的PSCA启动子较PSA等其他启动子具有以下优点：前列腺癌细胞的特异性高；PSCA通过GPI共价键锚定在细胞膜上，而不呈分泌形式，不易产生免疫耐受；PSCA不受雄激素的调节，能将钠/碘转运蛋白基因的转移至雄激素依赖性或者非依赖性前列腺癌细胞内，即能治疗激素依赖性和非依赖性前列腺癌。该方法思路独特，新颖，在国内外尚无类似研究报道。5、年度研究计划及预期研究结果。51、年度研究计划2004年1月至2004年6月：构建重组腺病毒PSA/NIS载体，鉴定
25、目的基因2004年7月至2005年12月：观察体外转染、表达效率及131I对体外肿瘤细胞的杀伤力2005年1月至2005年6月：建立原位和转移前列腺癌动物模型2005年7月至2005年12月：完成重组腺病毒PSA/NIS载体的动物模型局部治疗2006年1月至2006年6月：完成重组腺病毒PSA/NIS载体的动物模型全身治疗2006年7月至2006年12月：完成数据统计，形成论文52、预期研究结果成功构建重组腺病毒PSA/NIS载体，通过NIS，放射性碘能够在激素依赖性和激素非依赖性的前列腺癌细胞内浓聚，对前列腺癌细胞具有很强的杀伤作用。发表论文4-6篇，成果以论文形式发表。（二）研究基础与工作
26、条件1、工作基础申请者长期从事泌尿生殖系肿瘤的基础研究，有一定的研究基础和技术平台，在前列腺癌早期诊断、肿瘤标记物测定和基因治疗方面的研究工作有着丰富的研究经验。本研究已有的工作基础:1、 参加课题的多数工作人员有多年蛋白质组学、细胞生物学研究经验，已掌握双向凝胶电泳、质谱分析、细胞培养、RT-PCR、Western blot、免疫组化等技术；（1）所在科室多年来一直从事前列腺癌的基因研究，近年来已获得多项项国家自然科学基金资助。用原位杂交技术检测前列腺癌的PSCA的表达情况，初步表明PSCA在前列腺癌中呈高表达；2、已成功建立前列腺癌DU145和LNCaP细胞株的裸鼠原位种植和转移模型；3、
27、具有腺病毒构建，转染的工作经验。4、2、工作条件 所在科室每年诊治前列腺癌患者上百例，具有充足的病人来源；所在单位中心实验室具有常规的层流细胞培养、免疫组织化学、分子生物学及细胞生物学仪器，以及荧光定量、RT-PCR仪等先进设备；与美国几所著名研究单位具有良好协作关系，信息来源快，便于学术交流，有助于课题的完成。3、申请人简历高小峰，男，长海医院泌尿外科主治医师、讲师。1973年9月出生，1996年7月毕业与第二军医大学海军临床医学系，同年分配至第二军医大学附属长海医院超声科工作。1999年9月考入第二军医大学附属长海医院泌尿外科，师从于著名的泌尿外科专家孙颖浩教授，攻读硕士学位；2001年7
28、月由硕士转为博士，从事前列腺癌诊治的基础及临床研究。能较好地完成泌尿外科常见疾病的诊治工作，独立开展泌尿外科的中小型手术。发挥专长，开展超声引导经直肠前列腺穿刺活检术，大大提高了前列腺癌的阳性诊断率，取得了很好的临床效果。参与科室的科研工作，参加了膀胱癌细胞株逃脱细胞衰老的相关基因的筛选与克隆、尿脱落细胞端粒酶活性测定诊断膀胱癌、膀胱癌相关基因的筛选与克隆、重组腺病毒转染膀胱移行上皮预防膀胱癌复发的实验研究、前列腺癌雄激素受体及其基因的研究、东西方人前列腺癌的比较研究、重组腺病毒转染膀胱移行上皮预防膀胱癌复发的实验研究、前列腺癌的微创治疗、前列腺癌的早期诊断和综合治疗等多项国家自然科学基金、国
29、家自然科学基金重大国际合作研究项目、军队十五临床重大攻关项目、军队十五规划重点攻关项目、军队杰出人才基金、上海市百人计划基金等多项研究工作。在本实验中负责选题、实验设计及具体进行本研究的部分实验操作。在本实验中负责选题、实验设计及具体进行本研究的部分实验操作。 国家自然科学基金项目申请书签字和盖章页(此页不用填写!) 申 请 者： 依托单位：中国人民解放军第二军医大学项目名称：以PSCA为启动因子重组腺病毒转染纳碘泵基因治疗前列腺癌 资助类别：面上项目 亚类说明：青年科学基金项目附注说明： 申请者承诺： 我保证申请书内容的真实性。如果获得基金资助，我将履行项目负责人职责，严格遵守国家自然科学基
30、金委员会的有关规定，切实保证研究工作时间，认真开展工作，按时报送有关材料。若填报失实和违反规定，本人将承担全部责任。 签字： 项目组主要成员承诺： 我保证有关申报内容的真实性。如果获得基金资助，我将严格遵守国家自然科学基金委员会的有关规定，切实保证研究工作时间，加强合作、信息资源共享，认真开展工作，及时向项目负责人报送有关材料。若个人信息失实、执行项目中违反规定，本人将承担相关责任。编号姓 名工作单位名称项目分工每年工作时间(月)签 字12345678910依托单位及合作单位承诺： 已按填报说明对申请人的资格和申请书内容进行了审核。申请项目如获资助，我单位保证对研究计划实施所需要的人力、物力和
31、工作时间等条件给予保障，严格遵守国家自然科学基金委员会有关规定，督促项目负责人和项目组成员以及本单位项目管理部门按照国家自然科学基金委员会的规定及时报送有关材料。依托单位公章 合作单位公章1 合作单位公章2 合作单位公章3日期： 日期： 日期： 日期：个人简历-1 个人信息中文姓名： 拼音姓名： 民族： 性别： 出生日期： 其他 ： 职称： 主要研究领域： 最高学位： 授予国别(地区)： 授予年份： 院士： 博士后： 办公电话： 家庭电话： 手机号码： 传真： Email： 个人网页： 所在单位： 所在院、系、所： 通讯地址： 邮政编码： 在研项目批准号(最多三个)： 最熟悉的研究领域(最多三个)： 简历
