1、项目名称：动物源性病毒跨种间感染与传播机制研究首席科学家：高福 中国科学院微生物研究所起止年限：依托部门：中国科学院一、研究内容本项目选择发病率高、危害严重的动物源性传染病如高致病性禽流感、狂犬病和虫媒病毒病等为研究对象，认识病原的致病机制，揭示病原的分子变异和进化规律，阐明新发传染病跨种间传播的分子基础；并开展其生态学研究以及动物作为某些病原的天然贮存宿主的机制。拟解决的关键科学问题：1. 动物源性人类新发病原的致病机制动物源性人类新发病原的致病性取决于宿主与病原的关系，病原与细胞受体结合是感染的首要步骤。病原与其细胞受体的相互作用启动了细胞的一连串动力学反应。研究病原与受体的作用可揭示病毒
2、与宿主细胞的相互关系，明确病毒的细胞、组织、器官、宿主嗜性、进人细胞机制及其对宿主细胞的影响;阐明病毒的致病机制，弄清病毒融合和侵入过程、复制动力学及其引起的一系列细胞内过程。2. 动物源性人类新发病原的分子变异和进化规律病原特性取决于其基因组的结构与特点，新发传染病在绝大多数情况下是通过病原的基因变异、基因重组、基因重排等方式突破原有物种间的屏障，在其他物种间引发新型传染病的流行。在传播中所涉及的宿主个体愈多，其受到的选择压力的累积效应就愈大，又加大了病原发生进化的动力。掌握病原的分子变异和进化规律，不仅可了解病毒在群体感染过程中的进化趋向，而且对一些新病原的出现和其可能来源做出判断，并且通
3、过现代分子生物学技术如反向遗传操作技术等预测新型病原对人类的威胁和危害，进一步揭示如侯鸟与禽流感传播的相关性等摆在我们面前的重大科学问题。3. 动物源性人类新发传染病跨种间传播的分子基础病原基因变异所引起的致病性、抗原性及对宿主细胞嗜性等的改变是新型病原跨种间传播的分子基础。基因组重要位点的关键基因突变可导致病原对宿主细胞嗜性的改变，集中在几个重要的基因片段或重要变异点深入进行研究，寻找导致跨种间传播关键基因的决定子是当前要解决的关键问题之一。4动物源性病毒的自然生态与传染病发生的关系生态环境的恶化导致了许多人类传染病的产生，动物在自然状态下正常活动也可能将新的病原体传播给人类，人与动物越来越
4、密切的接触更直接地导致病原体侵入人类社会。所以，研究病毒相关动物类群在自然状态下的生态与病原体传播和扩散，探讨病原体与自然宿主之间的协同进化关系等问题，是解决自然疫源性疫病来源的重要途径。5. 动物源性人类新发传染病模型动物的建立模型动物是研究传染病发病机制、传播机制以及预防和治疗的重要手段。理想的疾病模型应具备再现性好、复制率高以及专一性好等特点。模型动物的建立和发展促进了现代医学的飞跃。建立人类新法疫病的动物模型，不但使我们可正确认识新发病原的致病机制、传播机制，更重要的是我们研发疫苗和评价药物效果等研究中的重要手段。主要研究内容1. 病毒与宿主细胞受体的作用机制以禽流感病毒和乙型脑炎病毒
5、等为突破口，阐明病毒与受体的亲和特性以及和配体的相互作用机制，分析跨种群传播多种细胞系感染和复制机制，解析病毒跨种间感染分子基础；并根据宿主高度保守的受体蛋白和病毒囊膜蛋白的受体结合设计疫苗和药物，提出行之有效的防治措施；根据目前国情的急需，重点研究我国当前H5N1亚型流行毒株与不同嵌合类型细胞受体的亲和特性和基因组变异对嗜性改变的影响，了解当前禽流感病毒对人和动物细胞受体的亲和特点，解析当前流行病毒的遗传进化特性，阐明对人类的潜在危害，为防控政策的制定提供科学依据。2. 病毒功能蛋白与宿主细胞内蛋白的相互作用组学以禽流感病毒和朊病毒等为突破口，利用酵母双杂交和串联亲和纯化技术筛选与病毒发生相
6、互作用的宿主细胞蛋白。对基因进行定点突变，寻找蛋白与细胞靶蛋白发生结合的关键位点，同时从细胞水平观察病毒蛋白与细胞蛋白的相互作用对病毒在细胞内复制的影响。观察病毒突变体和野生株在致病力和感染力等方面的差别。利用特异性的朊病毒多肽进行神经细胞朊病毒受体基因表达的定量，同时采用蛋白组学的研究方法确定参与蛋白构象变化的宿主细胞因子，确定宿主的致病位点与朊病毒的遗传关系，分析相关蛋白质的多态性，对朊病毒的种间屏障进行免疫学的分子基础分析。3. 媒介/中间宿主在人畜共患病发生中的作用研究狂犬病毒和乙型脑炎等病毒等溯源，以野生动物如蝙蝠、果子狸等为主要研究对象，开展病毒在野生动物中的生态学研究，确定其在自
7、然界的最终动物宿主、病毒自然宿主库和地域分布。研究狂犬病毒等重要流行毒株跨种感染机理；研究不同动物（猪、鸭、鹌鹑等）在流感病毒进化与传播中的作用和病毒在免疫压力下的遗传与变异规律；蚊虫为代表的媒介在乙脑、登革热（热带）、出血热等病毒中中介作用的分子生态学基础，建立病毒资源库、基因储备库和生物信息库。4. 自然贮存宿主在病毒传播中的作用 以蝙蝠源病毒和狂犬病病毒为突破口，确定我国境内蝙蝠体内感染和携带的几种已知人类重要病毒的种类、分布及其变异规律，弄清狂犬病毒在野生动物之间的传播链，野生动物行为生态学与病毒协同进化之间的相互关系，弄清不同基因型狂犬病毒的地域分布情况。评价未知病毒对人畜的潜在危害
8、，研究病毒在蝙蝠等重要贮存动物贮存和传播的分子机理。调查禽流感病毒在侯鸟中的存在状况，研究侯鸟迁徙与疫病流行的关系，为疫病防控政策的制定提供理论依据。5. 模型动物在研究跨种间感染中的作用以H5亚型高致病性禽流感病毒、猪戊型肝炎病毒和狂犬病病毒等为突破口，建立致病和跨种间传播的动物模型。系统分析病毒在哺乳动物模型的感染和致病能力。利用建立的模型动物，阐明H5亚型禽流感病毒等的分子致病机制; 同时利用反向遗传操作系统，研究决定病毒跨越宿主屏障能力以及致病力的分子机制，为人类新发动物源性疫病的预防和控制提供信息及理论技术支撑。二、预期目标总体目标通过本项目的研究，阐明目前主要动物源性病毒病的致病机
9、理、发生机制和跨种间传播的分子和细胞生物学基础科学问题，确定病毒功能蛋白基因的遗传变异与致病性、宿主范围、分子生态进化等关系，揭示动物源性病毒病的分子发生机理，在病毒演化规律、种间屏障突破机制、病毒与细胞受体关系和宿主细胞内蛋白的分子作用机制方面取得创新性成果，推动我国在该领域的研究达到国际先进水平，为研发动物源性新发人类传染病的科学控制技术提供理论根据，进而为国家经济发展、社会稳定、公众健康提供科学可信的保障。五年预期目标1. 确定主要病毒识别宿主细胞受体的进化规律与跨种间感染的分子机制，可考核指标如下：（1）利用遗传学方法，进行基因突变，体外真核表达病毒识别宿主细胞受体蛋白，研究这些基因上
10、的一些重要的结构位点的改变，对其受体结合功能和侵入细胞功能的影响，以及与病毒高致病力的关系，从而深入了解病毒的致病机制及变异规律，探索抑制病毒入侵的方法。（2）在分子水平上进一步了解和认识毒种间传播机理，并针对病毒吸附和侵入分子机制，设计小分子药物阻断剂。（3）应用哺乳动物细胞转染等现代技术，在不用操作活病毒的基础上，找寻黄病毒受体。2. 建立主要病毒蛋白与人类宿主细胞内蛋白互作组学平台，可考核指标如下：（1）研究病毒蛋白与宿主细胞内蛋白的相互作用，筛选与病毒相关蛋白发生相互作用的细胞内靶蛋白，探讨相关新蛋白与靶蛋白之间的相互作用对病毒复制、装配、出芽等方面的影响。（2）阐明蛋白的相互作用在病
11、毒复制过程中以及感染后细胞发生病变的分子机制、种间屏障突破机制和种间差异的分子机制。（3）提供研制小分子药物治疗动物源性病毒病的理论依据。3. 建立主要动物源性病毒天然贮存宿主的病原生态学研究平台，可考核指标如下：（1）确定禽流感、狂犬病毒等病毒的起源、病毒自然宿主库、流行病学和分子流行病学、遗传变异和分子进化以及跨物种感染机制。（2）解析病毒在生态链中的传播规律以及病毒与家养动物、野生动物之间的协同进化规律，确定病毒在自然界的最终动物宿主和病毒自然宿主库以及病毒的地域分布图。（3）比较不同地理区域，不同动物来源病毒的遗传信息，揭示其变异和分子进化规律及跨物种感染的生态进化规律。4. 建立动物
12、源性疾病的生态传播模型，可考核指标如下：（1）确定我国主要媒介动物蝙蝠体内感染和携带的几种已知人类重要病毒的种类、分布及其变异规律的分子流行病学。（2）通过血清学和分子生物学检测手段调查不同地区不同季节蝙蝠体内病毒的携带或感染状况和分布规律。（3）了解未知病毒的种类、分布和敏感宿主，评价未知病毒对人畜的潜在危害。（4）提供未知病毒的检测和预防方法，建立新生病毒血清学和分子生物学诊断、监测技术。5. 建立H5亚型病毒和猪戊型肝炎病毒等动物模型，可考核指标如下：（1）系统分析H5亚型病毒和猪戊型肝炎病毒在哺乳动物模型的感染和致病能力，并建立禽流感、猪戊型肝炎病毒和狂犬病等动物模型。（2）利用建立的
13、模型动物，阐明H5亚型禽流感病毒等的分子致病机制。（3）利用反向遗传操作系统，研究决定病毒跨越宿主屏障能力以及致病力的分子机制。三、研究方案总体思路：综合现代病原生态学、分子病毒学、分子生物学、生物信息学、细胞生物学和生物化学等，利用学科交叉，发挥多学科优势，从群体、个体、细胞、分子不同层次上，研究动物源性病原的结构、致病性、分子生态、跨种间传播的发生机理。重点围绕动物流感病毒、日本乙型脑炎病毒、狂犬病病毒、朊病毒、副粘病毒等动物源性病毒，以解决这些疾病致病机理和跨种间传播发生机制为关键，从不同角度对这些病原的分子致病特性、与宿主细胞的相互作用关系、媒介传播与宿主之间的关系、物种之间种间屏障基
14、础进行系统深入的研究。技术路线：详见流程图（图1）。本研究的技术路线将全面系统地深入研究当前危害严重发病率高的重要动物源性病毒的致病性及其进化的分子基础，疾病传播的遗传规律和种间传染的分子基础。动物源性病毒疾病跨种间感染研究方案示意图可行性分析：1. 本项目中有动物学、生态学、分子病毒学、分子免疫学、分子生物学等学科的交叉，集成与优势互补可以创新一系列方法，使我们有能力解析动物源性传染病的发生机制，例如蛋白质组学技术中蛋白质1D和2D电泳、酵母双杂交、蛋白质芯片技术等技术的综合构成了研究病毒与宿主细胞相互作用的技术平台。2. 本项目集中了国内最强势的动物传染病学、分子病毒学与生态学、分子免疫学
15、研究队伍，首次在国内大规模协作、系统开展动物源性新发人类传染病发生机制的基础研究，由此而构建的平台对快速解决今后新发疫病的防控有重要作用。3. 本项目的研究领域属于国际热点领域，研究内容属于该领域的前沿，国际上该方面的研究多数属于某一环节的研究，涉及多个层面上的系统研究还较有限，我们集中国内的优势力量，极有可能在该领域取得一些突破性成果。4. 参与单位具有良好的工作基础，承担过在新发传染病相关领域的国家自然科学基金、863项目和国家攻关项目，有了相当的积累，具备开展本研究的工作基础。创新点与特色：1. 本课题紧紧抓住动物源性病毒在人类及其它动物中存活、增殖并可能同时致病的特点，从分子生态与分子
16、进化（群体）和蛋白质互作（个体）的独特视角，系统探讨跨种传播模式及其相关机制。2. 运用分子生物学与细胞生物学手段，阐明病毒在其媒介及终末宿主中生物学特征差异的细胞与分子基础，为进一步设计干预这种传播链的新型抑制剂提供依据。3. 通过对同种病毒在不同种属动物及人类中使用受体及与宿主细胞因子互作的不同，探寻人畜（动物）共患病发生与致病机制，为设计新型药物与疫苗提供理论基础。4对一些可能传入我国的重要动物源性病毒进行预研，防患于未然，尤其是在东南亚和附近地区已经形成严重态势、我国境内又有相关动物贮存宿主的病毒。5. 通过模型动物的建立，分析禽流感病毒、戊型肝炎病毒等对哺乳动物的感染性和致病能力，并
17、利用现代基因操作技术研究病毒跨种间传播的分子遗传机制。四、年度计划研究内容预期目标第一年研究病毒识别宿主细胞受体蛋白基因重要结构位点对其受体结合功能和侵入细胞功能的影响，筛选与病毒蛋白发生相互作用的宿主细胞蛋白，探索抑制病毒入侵的方法；不同动物在重要病毒贮存、进化与传播中的作用；病毒在哺乳动物模型的感染和致病能力，并建立禽流感、猪戊型肝炎病毒等动物模型。（1）体外制备病毒识别宿主细胞受体蛋白，了解病毒的致病机制及变异规律，探索抑制病毒入侵的方法。（2） 筛选出23种与病毒蛋白相互作用的宿主细胞内蛋白。（3）明确禽流感病毒、狂犬病毒等病原在野生禽鸟、动物和家畜的生态分布和病毒进化特点。（4）查明
18、重要贮存宿主如蝙蝠等体内重要病毒的携带状况，并进行病毒基因变异和分子进化特征分析。（5）建立H5亚型病毒和猪戊型肝炎病毒等动物模型。第二年研究病毒蛋白与宿主蛋白的相互作用对病毒复制的影响，在分子水平上认识病毒种间传播机理，并针对病毒吸附和侵入分子机制，研究设计小分子药物阻断剂；研究在不同动物在流感病毒进化的作用以及病毒在选择压力下的变异规律；研究病毒在蝙蝠等重要贮存动物贮存和传播的分子机理；研究建立评价决定病毒跨越宿主屏障能力以及致病力分子机制的操作技术平台。（1） 针对病毒吸附和侵入分子机制，设计46种小分子药物阻断剂。（2）应用哺乳动物细胞转染等现代技术，在不用操作活病毒的基础上，找寻黄病
19、毒类受体。（3）建立禽流感病毒和狂犬病病毒等病毒资源库、基因储备库和生物信息库。（4）病毒在蝙蝠等重要贮存动物贮存和传播的分子机理。（5）建立稳定的反向遗传操作技术平台。第三年病毒功能基因组的变异对病毒受体结合位点识别功能、致病性及嗜性的影响；选择压力对基因组结构和蛋白质结构的作用；比较不同地理区域，不同动物来源病毒的遗传信息，建立病毒资源库、基因储备库和生物信息库；系统分析病毒在哺乳动物模型的感染和致病能力。（1）筛选对病毒繁殖功能影响大的小分子阻断剂。（2）揭示禽流感病毒等变异和分子进化规律及跨物种感染的生态进化规律。（3）了解未知病毒的种类、分布和敏感宿主，评价未知病毒对人畜的潜在危害。
20、（4）利用建立的模型动物，阐明H5亚型禽流感病毒等的分子致病机制。第四年构建并筛选基因突变病毒变异株，观察病毒变异株和野生株对动物感染力和致病性的差别。病毒功能基因组的变异对病毒受体结合位点识别功能、致病性及嗜性的影响；研究鸟类动物迁徙与疫病流行的关系；反向遗传操作系统，研究决定病毒跨越宿主屏障能力以及致病力的分子机制。（1）确定宿主细胞内蛋白对病毒复制、装配和出芽的影响。（2）阐明禽流感病毒、狂犬病病毒、戊型肝炎病毒等分子流行病学。（3）调查禽流感病毒在迁徙鸟中的生态。（4）深化研究禽流感病毒的致病机制和跨种间传播的分子机制。（5）建立未知病毒的检测方法和技术。第五年病毒基因变异对病毒受体结合位点识别功能的影响；免疫压力对病毒抗原和基因组的作用；病毒新受体的寻找；大批小分子阻断剂的研发；动物源新发病毒的调查以及分离培养方法和致病性评估。（1）阐明新发动物源病毒性传染病的发生特点、流行特征及跨种间传播的机理。（2）研发一批具有良好应用前景的抗病毒阻断剂。（3）制定有关预防新发传染病的措施，为政府制定政策提供理论支撑，为研发动物源性新发人类传染病的科学控制技术提供理论根据。（4）课题总结和验收。
