人类重要病原体致病机制研究 (2).doc

1、项目名称：人类重要病原体致病机制研究首席科学家：金奇 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所起止年限：依托部门：卫生部一、研究内容本课题研究围绕病原体变异及变异与致病性的关系这个传染病基础研究中的核心科学问题，分别针对乙型肝炎病毒、艾滋病毒和肠道病原菌的生物学及致病特点开展相关研究。一、乙型肝炎病毒遗传学特征及其致病和致癌相关性研究本项目主要研究内容包括：（1）分析我国HBV基因型及重组体的分布特点以及与疾病谱和抗病毒治疗应答的关系；（2）研究HBV蛋白和细胞因子相互作用的生物学功能，探讨HBV感染、致病和致癌机理；（3）研究抗原特异性免疫在乙肝发病与转归中的作用及其网络调控机制。1分析我国HB

2、V基因型及重组体的分布特点以及与临床疾病谱和抗病毒治疗应答的关系（1）HBV遗传变异及其分子流行病学研究（2）病毒因素、宿主因素、核苷类似物抗病毒治疗应答相关性研究主要包括：不同HBV基因型肝组织病变的特点，HBV基因型与临床疾病谱和HBeAg血清学转换的关系，基因型与抗病毒治疗应答的关系；比较研究纯种C和D基因型以及我们鉴定的D/C重组体三种毒株的临床分子病毒学特点；将重组体的重组区域与纯种基因型原位置换，应用转染细胞系研究D/C重组体与纯种C和D基因型对病毒复制和抗原表达的影响；同时共转染遗传背景不同的细胞系，研究有无毒株选择优势；在系统分析不同基因型和重组体基因组学特点的基础上，优化和改

3、进现有HBV基因分型方法，提出新的基因分型体系。2 研究HBV蛋白和细胞蛋白相互作用的生物学功能，探讨HBV感染、致病和致瘤的分子机理（1）建立以杆状病毒为载体的HBV感染新技术平台，筛选与HBV感染相关的细胞因子及其功能性研究（2）研究与HBV病毒复制、转录、病毒颗粒装配相关的基因在HBV病毒生活周期中的功能（3）探索HBV感染的受体和辅助受体（4）分离、鉴定与HBx蛋白相互作用的新细胞蛋白（5）与HBx相互作用蛋白因子的表达差异研究（6）超表达HBx蛋白及其相互作用细胞蛋白对细胞生理功能的和HBV病毒的影响（7）抑制与HBx蛋白相互作用蛋白表达后对细胞生理活性和HBV病毒的影响（8）在实验

4、动物水平HBx蛋白及其相互作用蛋白的功能性研究利用Bac-to-Bac杆状病毒真核表达系统，构建含有完整HBV基因组的重组杆状病毒。利用该重组病毒感染不同肝细胞，选择一个或几个合适的细胞系作为研究HBV的分子生物学和药物的筛选的平台。利用杆状病毒能转导不同的肝细胞的特性，利用Microarray分析重组HBV感染前后细胞的转录谱，结合差减文库来筛选与HBV感染相关的基因。采用蛋白质二维电泳、质谱，结合蛋白质组学和噬菌体展示文库，最新的组织表达蛋白或者DNA芯片等现代生物学技术分离并鉴定HBV感染相关的受体和辅助受体。采用酵母双杂交系统筛选和差异表达文库分析等方法，寻找与HBx蛋白相互作用的细胞

5、蛋白，研究HBx蛋白与其相互作用细胞蛋白对细胞凋亡、细胞转化、增殖等生物学功能。在细胞和组织水平上分析HBx蛋白相互作用细胞因子的表达差异，研究新的相互作用细胞因子的生物学功能。HBx蛋白与激活的ras、Myc等肿瘤因子相互作用对细胞转化以及试验动物致瘤性的影响，并借助现代分子生物学、细胞生物学、分子病毒学技术阐明HBx蛋白及其相互作用的细胞蛋白对细胞凋亡、生长特性等的影响作用途径，深入探讨HBV致病和致癌的分子机制。3研究抗原特异性免疫调节T细胞在病毒性肝炎发病与转归中的作用及其网络调控机制（1）中国旱獭嗜肝病毒急、慢性感染模型的建立（2）中国旱獭嗜肝病毒模型在HBV感染相关疾病研究中的实际

6、应用（3）利用小鼠模型研究特异性Tr细胞包括DN Tr在调节机体产生适度的免疫反应以清除肝炎病毒、抵抗感染中的作用和作用机制（4）CD4或CD8淋巴细胞耗尽后对MHV-3所致重症肝炎炎性反应的影响（5）特异性Tr 包括DN Tr 的MHV-3抗原特异性免疫保护作用和机制（6）研究特异性Tr细胞包括DN Tr在乙型肝炎发病中的作用、机制及应用（7）特异性Tr 和DN Tr 的HBV抗原特异性免疫保护作用和机制拟建立旱獭嗜肝病毒动物模型，不仅价格便宜且容易获得，适合在中国推广使用，而且该动物模型是建立在国际认可的土拨鼠模型的基础上，能得到国际同行的认可和接受。因此这种适合中国国情的经济适用的嗜肝病

7、毒动物模型的建立，不仅将为研究HBV感染的发病机制和筛选合适的抗病毒药物和治疗性疫苗提供很好的技术平台和研究工具，而且将大幅度提高我国在HBV感染相关疾病研究上的整体水平。本部分还将进行下述研究：利用小鼠模型研究特异性Tr细胞包括DN Tr在调节机体产生适度的免疫反应以清除肝炎病毒、抵抗感染中的作用和作用机制。不同种系小鼠MHV-3感染前后T细胞亚群的动态观察，CD4或CD8淋巴细胞耗尽后对MHV-3所致重症肝炎炎性反应的影响，特异性Tr 包括DN Tr 的MHV-3抗原特异性免疫保护作用和机。研究特异性Tr细胞包括DN Tr在调节机体产生适度的免疫反应以清除HBV、抵抗感染中的作用和作用机制

8、。不同临床类型乙型肝炎患者T细胞亚群的观察，特异性Tr 和DN Tr 的HBV抗原特异性免疫保护作用和机制。二、乙型肝炎病毒变异及与宿主相互作用的分子与免疫机制1、预防疫苗无应答、治疗性疫苗免疫效果和HBV免疫损伤的机理研究。对不同临床类型、病毒学指标、病理背景的HBV感染病例及对预防疫苗无应答的人群进行细胞免疫状况的分析，明确CTL、DC、Th细胞等以及不同亚群之间的关系，以阐述细胞免疫与临床表现、病毒学指标、免疫应答和免疫病理之间的关系。2、HBV持续表达大量HBsAg的细胞学基础、其作用机制及其导致的效应将采用持续表达HBsAg的转基因鼠及稳定表达HBsAg的细胞系。整体思路是从细胞微生

9、物学的角度,研究HBV S 基因持续表达HBsAg对宿主细胞功能及细胞蛋白的影响及作用。所用的技术涉及转录体组学和蛋白质组学，因此本研究也可看作是对HBV感染的系统生物学研究的一个切入点。3、控制HBV复制能力的细胞蛋白及HBV 拮抗干扰素机理的研究。拟利用乙型肝炎体外病毒复制细胞系统和肝炎患者，在乙肝病毒感染和或干扰素作用下，比较两者间的基因组和蛋白组的背景差异，鉴定或发现表达水平差异显著的已知或未知蛋白，并对高度差异的基因及其表达产物通过RNAi、细胞融合、组织病理学等加以明确，以研究乙型肝炎病毒与干扰素在宿主细胞内的相互作用，并进一步探索其分子机制，一方面研究干扰素诱导的细胞基因在抗病毒

10、及信号传导途径中的作用；另一方面研究乙肝病毒在细胞内基因复制和蛋白表达对干扰素合成,调节信号通路和效应蛋白的影响。三、艾滋病毒变异与流行和致病及免疫机制的研究HIV对宿主的感染是完整而有序的连贯过程，涉及宿主的信号系统、膜系统和细胞骨架系统。HIV的变异及重组是影响病毒的流行和致病性的主要因素，而机体的免疫反应在宿主抗病毒防御中起决定性作用，结合HIV与宿主细胞及超感染病毒间相互作用的研究，发现新的预防和治疗策略以及靶位点，为控制艾滋病提供新的思路。针对上述特点，本课题待解决的主要科学问题包括：1、艾滋病毒的变异规律及其意义。包括不同病程时期重组艾滋病病毒各基因区的变异特征、规律及其与病毒复制

11、能力、疾病病程及转归之间的关系。2、免疫反应在抗HIV感染防御体系中的作用。包括IgA在抗HIV粘膜相关特异免疫中的作用，IgA、CTL、中和抗体以及排斥免疫参与抗HIV粘膜防御的机制，CTL、T细胞表位及中和表位与病毒逃逸的关系，HIV侵入后急性感染阶段参与控制病毒早期复制的免疫细胞类型，以及粘膜上皮细胞、树突状细胞和淋巴细胞在HIV-1粘膜传播和抗HIV-1粘膜免疫形成中的作用等。3、病毒与宿主相互作用对HIV致病性的影响。包括疱疹病毒和HIV相互作用的过程及疱疹病毒超感染对HIV的影响，HIV内吞出芽与细胞内吞途径间的相互关系，HIV侵入过程中膜蛋白的构象变化及内吞和出芽的分子机制等。针

12、对上述问题，拟开展以下3方面研究：1、HIV变异及与致病性关系的研究分别以新发感染队列人群、长期不进展者与慢性感染队列人群为目标人群，观察病毒在感染早期与慢性期其Tat、LTR、env和gag基因区的变异率，探讨我国CRF07_BC重组艾滋病毒在感染早中期基因特征和年度变异频率，分析病毒基因变异规律；在上述不同队列中连续观察并分离不同病程时期的我国重组HIV病毒株，从生物学、分子病毒学和流行病学等层面研究我国重组HIV毒株的细胞嗜性（M/T嗜性）、致细胞病变性（SI/NSI）、复制动力学和辅助受体的使用情况；确定其保守的V3环在重组病毒不发生NSI到SI转换所起的作用，并阐明其机制；通过检测不

13、同变异tat和LTR感染性克隆复制水平的高低，阐明重组病毒感染者病毒载量明显偏低的机制及其不同变异tat和LTR基因在其中所起的作用和相互作用机制；揭示该重组毒株拷贝低、病程长和发病晚的原因；根据上述研究结果结合分子流行病学研究，分析该重组病毒在我国迅速流行的病毒学原因。2、抗HIV的免疫反应影响HIV致病性的研究。在已建立的新发感染、慢性感染和长期不进展者队列中观察T细胞免疫反应并测定在疾病不同时期HIV特异性T细胞的数量与功能变化，同种异体排斥T细胞反应在保护机体免于HIV感染中所起的作用，体液免疫尤其是中和抗体在保护性免疫中所起的作用；在阐明免疫保护机制的基础上探索病毒逃逸的机制以及逃逸

14、病毒在疾病进展与病毒传播中所起的角色。获得抗HIV不同组分包括gp120, gp41, pol, gag等的IgA单克隆抗体，测定其在细胞内外的抗病毒效应，以及与粘膜相关的抗病毒功能；利用粘膜上皮细胞模型测定HIV蛋白特异性的IgG和IgA单克隆抗体抗HIV病毒的多重效应；了解HIV蛋白特异性的IgG和IgA单克隆抗体与粘膜间的相互作用及在粘膜防御中的功能特征。确定中国HIV-1 B与HIV-1 C亚型毒株全长感染性克隆和单复制周期侵染性克隆的遗传、生化及其免疫学特性，为本项目其它问题的研究提供有效工具；研究被SHIV-B与SHIV-C感染的免疫细胞功能缺失；利用体外细胞培养模型和猴个体间自然

15、传播动物模型研究病毒粘膜传播早期上皮细胞、树突状细胞与淋巴细胞的作用。3、病毒/宿主相互作用及病毒超感染影响HIV致病性的研究。利用疱疹病毒与HIV超感染模型，借助蛋白之间相互作用分析、RNA干扰和蛋白激酶分析等手段，阐明对HIV LTR启动子活性影响最大的NF-kB通路和AP-1通路，建立系统完整的作用模型；利用疱疹病毒立即早期基因产物具有泛素连接酶E3活性的特点，将它们作用于来自宿主或超感染病毒的特定调节因子，研究这些产物对HIV基因表达的影响；研究HIV Tat和宿主蛋白间的相互作用，并对COX-2等Tat相关蛋白的致病机理进行研究；分析HIV-1囊膜蛋白gp41介导膜融合的过程，通过定

16、点突变改变gp41的功能区域，构建HIV-1融合中间状态的突变体，并解析这些突变体的结构，研究囊膜蛋白在与细胞融合阶段的分子结构和构象变化过程；通过药物、诱变和抗体特异阻断不同的内吞途径，研究HIV-1病毒和细胞内吞的关系，寻找抑制HIV-1感染新的潜在靶点。四、重要肠道菌毒力岛、致病基因调控与系统生物学研究1大肠杆菌O157：H7 OI28、OI172等毒力岛的功能研究及分布和转移规律的研究对OI28岛的研究重点为其否是为白细胞特异性毒素,对OI172岛的研究重点是其对大肠杆菌O157:H7动力和黏附力的影响,进行深入研究。使用一步PCR技术对O157:H7大肠杆菌基因组岛OI28和OI17

17、2上的基因进行逐个定位灭活,构建精确缺失株。获得缺失突变株后，（1）使用蛋白质组技术研究在不同条件下缺失基因对细菌蛋白表达的影响；（2）根据所影响的蛋白质种类和功能，设计实验，研究功能；（3）使用或发展动物或细胞模型，研究各基因组岛的基因缺失株的致病性变化；（4）借助芯片技术从RNA表达上观察对其他毒力岛及毒力基因表达的影响。然后进行综合分析，确定OI28/OI172岛的作用及其功能蛋白。同时,对其他大肠杆菌中OI28岛的分布及功能进行研究：对携带OI28岛的大肠杆菌的研究重点是筛查这些菌株是否具有其它毒力岛、基因组岛，OI28岛的功能，评价其是否能够发展成为新的病原菌的可能性。2痢疾杆菌与宿

18、主相互作用及其重要毒力相关基因的表达调控研究模拟体内外环境（如不同温度、低pH、肠道环境、HeLa细胞侵袭试验、家兔肠结扎模型等）利用基因芯片和蛋白质组技术找到差异表达的基因或蛋白（可能的毒力相关基因或蛋白），并进一步克隆表达上述基因及构建相应地突变体，用细胞或动物模型评价它们的功能，最后进行综合分析这些差异表达基因针对不同的环境条件可能的诱导表达调控模式，进一步阐述痢疾杆菌与宿主相互作用的机理。3、肠道病原菌基因组结构组成、毒力岛等功能岛的分布规律以及与致病性关系和进化关系的分析在完成志贺氏菌属不同群代表株以及EIEC等重要肠道病原菌的全基因组序列的基础上，制备生物芯片，利用生物信息学及生物

19、芯片技术对重要肠道病原菌（包括动物肠道病原菌）基因组结构与差异进行扫描与分析。结合功能基因研究方法研究重要肠道病原菌基因组结构与差异及其差异与生物学性状等的关系以及重要动物肠道病原菌基因组成,同时认识重要肠道病原菌（包括动物肠道病原菌）的系统进化关系。利用我们已发展的毒力岛芯片，开展：（1）已知各类肠道菌属中毒力岛分布状况的筛查，根据毒力岛的分布规律，了解肠道菌中毒力岛水平传播的规律，推测肠道病原菌毒力进化的可能机制；（2）传染病流行中不同分离株的毒力岛筛查，了解毒力岛在不同分离株间的分布规律，解释毒力岛与细菌变异及传染病流行间的关系；（3）未知病原菌的毒力岛检测，了解其毒力岛的携带状况，从而

20、为确定新病原并解释其发生机理和可能的致病机制提供依据。肠道病原菌的变异、进化及致病性主要涉及毒力岛等基因组元件，因此有关毒力岛等基因组元件的研究成为病原菌致病机制以及进化变异的核心问题之一。此外，病原菌与宿主间相互作用机制研究和不同物种肠道病原菌结构与功能差异等研究对于阐明肠道致病菌的致病机制、进化变异规律（跨物种传播）具有重要的理论和实际意义。五、新病原微生物分离与鉴定RNA病毒的分离与富集研究；呼吸道和消化道病原微生物分子标识的鉴别研究；病原微生物组合筛查研究；新型病原微生物诊断材料和方法研究。二、预期目标本项目的总体目标以乙型肝炎病毒、艾滋病毒和肠道病原菌的变异及与致病性的关系这一重要科

21、学问题为中心，充分发挥学科间交流与合作的优势，从微体、个体、群体三个层次采用现代分子生物学、遗传学、免疫学、细胞生物学技术，分别从病原体的分子结构与功能、基因组、变异、致病机理和机体免疫应答机理等方面进行系统研究。通过本项目的实施，将对上述病原体引起的疾病的本质有所阐明，对其变异、致病机理和机体防御的分子机制有所了解，并研制出多种有可能应用于临床防治的新型疫苗、药物和诊断新技术。通过课题的实施，培养一批人才，推动传染病基础理论水平的提高，同时为相关产业提供原始创新的基础，提升我国传染病防治的整体水平。一、乙型肝炎病毒遗传学特征及其致病和致癌相关性研究1. 总体目标本项目以HBV遗传变异以及与细

22、胞相互作用做为本研究的核心和切入点，明确各种HBV基因型及其重组体在我国不同地区和人群中的分布及演变，阐明HBV不同基因型重组体的种类、生物学特性和临床意义，全面鉴定不同HBV基因型和HBV变异株中存在的HLA限制性HBV CTL新表位，科学解析HBV基因型、HBV变异及HLA-A限制性HBV特异性CTL应答改变之间的内在相关性。研究病毒感染、致病与致癌分子机理等重要科学问题，结合目前现代分子生物学、遗传学、免疫学、细胞生物学的前沿和新的增长点开展HBV感染受体及其致病、致瘤的分子机制，探讨HBV感染防治的新策略，为从根本上防治病毒性肝炎及其相关性肿瘤奠定基础，为提高人民身体素质提供依据。同时

23、培养一批在HBV研究和防治方面的高素质人才。2. 五年目标针对上述主要研究内容，5年的预期研究目标如下：（1）阐明我国重要HBV突变株的变异规律及流行特点。（2）筛选与HBV病毒复制与转录等相关基因，探索病毒感染机制。（3）鉴定10种以上新的与HBV蛋白结合的细胞因子，在此基础上，阐明病毒致病、免疫、致癌的分子机制。（4）阐明肝炎病毒抗原特异性Tr细胞在人类HBV感染导致肝炎病程发展过程中的作用机制。（5）提供12个可进行进一步研究的用于HBV感染诊断和治疗的新技术、新制剂。（6）建立杆状病毒表达载体的HBV感染细胞模型，建立旱獭嗜肝病毒动物模型和小鼠模型。（7）发表论文15-20篇，总IF不

24、低于50。（8）申报专利2-5项。二、乙型肝炎病毒变异及与宿主相互作用的分子与免疫机制探索我国人群和乙肝患者免疫应答状态与致病、治疗效果和免疫应答的关系，发现树突状细胞、调节T细胞、杀伤性NKT细胞等与乙肝病毒感染的关系，提供治疗乙肝病毒慢性患者特别是HBsAg携带者的新策略；阐明支持乙肝病毒在细胞内特异、持续复制尤其是持续表达大量HBsAg的生物学机制，促进病毒学基础理论的发展。了解乙肝病毒基因复制和表达对细胞的影响以及在细胞和分子水平了解病毒在细胞内持续存在的机制；发现一些新的抗HBV作用靶位和生物因子，特别是类似干扰素样作用的较为特异的抗HBV生物因子，取得自主知识产权，在抗HBV治疗的

25、生物基础研究中取得突破。1、发表论文10-20篇，总IF不低于502、申报专利3-5项三、艾滋病毒变异与流行和致病及免疫机制的研究1、揭示艾滋病毒的变异规律及病毒变异对致病性的影响。分析病程不同阶段CRF07_BC重组病毒各基因区的变异规律及对免疫保护与免疫逃逸的影响；阐明该重组病毒的基因变异与病毒复制能力、疾病病程及转归之间的关系；确定CRF07_BC重组艾滋病病毒env基因不同区域的变异特征与病毒辅助受体使用保守性之间的关系。2、阐明抗艾滋病毒感染的免疫防御机制，特别是粘膜免疫防御的重要作用。初步揭示T细胞免疫与中和抗体在艾滋病疾病进展、病毒传播以及病毒逃逸过程中所起的作用。揭示IgA在抗

26、HIV粘膜相关特异免疫中的作用机制；分析中国HIV-1 B与C亚型毒株全长感染性克隆和单复制周期侵染性克隆的遗传、生化及免疫学特性；确定在HIV侵入后的急性感染阶段参与有效控制病毒早期复制的免疫细胞类型；了解上皮细胞、树突状细胞和淋巴细胞在HIV粘膜传播和粘膜保护中的作用。3、深入了解病毒/宿主相互作用及病毒超感染对HIV致病性的影响。阐明疱疹病毒超感染对HIV基因表达和病毒复制的影响，探究病毒基因产物改变宿主蛋白质修饰状态并影响HIV基因表达的机理；全面认识HIV-1侵入过程中囊膜蛋白的构象变化及内吞和出芽的分子机制；分析宿主信号转导系统对HIV LTR启动子功能的影响及其调节过程，了解细胞

27、因子借助HIV Tat或Rev等蛋白调节HIV-1复制的机制。4、在国际著名期刊发表高水平的研究论文15-20篇（总SCI影响因子不低于60）；申报专利4-10项；申报省部级以上科技奖励1-2项。四、重要肠道菌毒力岛、致病基因调控与系统生物学研究初步阐明OI28岛和OI172岛等毒力岛的功能和致病作用以及在其它肠道细菌中的分布和转移特点；发现若干个新的肠道致病菌毒力基因或毒力岛并揭示其功能；找到1-2个痢疾杆菌可用于药物筛选或疫苗研制的靶位点；探索痢疾杆菌基因组的调控途径；分析多种肠道致病菌（包括动物病原菌）的进化关系。1. 发表论文10-15篇，总IF不低于352. 申报专利4项3. 省部级

28、以上科技奖励1-2项 五.新病原微生物分离与鉴定在新病原微生物的分离与鉴定上取得突破。发表论文的影响因子总和大于30，申请5-10相关专利。三、研究方案四、年度计划一. 乙型肝炎病毒遗传学特征及其致病和致癌相关性研究2005年12月-2006年11月在全国16个左右的中心收集样本及资料，进行初步的基因分型；随机选择基因型B与基因型D标本进行克隆测序，调查HBV基因型重组体流行状况；构建含有完整HBV基因组以及真核启动子启动下的绿色荧光蛋白标记基因的重组杆状病毒；采用酵母双杂交系统从人肝cDNA文库中筛选10种以上与HBV病毒蛋白HBx蛋白相互作用的细胞蛋白；完成与HBx相互作用蛋白因子的表达差

29、异的研究；建立RNA干扰技术平台，按一定的规则选择与HBx相互作用蛋白靶位点，构建以H1和U6启动子为基础的RNAi小分子表达载体；初步建立中国旱獭嗜肝病毒急、慢性感染模型；完成对肝脏局部侵润淋巴细胞表面标志的分析和外周血、脾脏淋巴细胞表面标志的分析；初步阐明淋巴细胞在不同种系小鼠感染前后的变化、参与对MHV-3感染敏感性与耐受性发生的可能细胞群，初步判断特异性Tr是否参与MHV-3所致重症肝炎炎性反应的免疫调节作用。2006年12月-2007年11月从各地区样本中随机抽取部分基因型B、C、D毒株，克隆后对其前S/S区、前C/C区进行测序，完成重组体的鉴定工作。完成变异是位于不同基因型HBV的

30、“共同序列区”还是“差异序列区”的分析工作。分析我国HBV基因型及重组体的分布特点以及与临床疾病谱和抗病毒治疗应答的关系；建立以杆状病毒为载体的HBV感染新技术平台，筛选几种与HBV感染相关的细胞因子。研究与HBV病毒复制、转录、病毒颗粒装配相关的基因在HBV病毒生活周期中的功能。对X蛋白对HCV感染的影响做出评价；完成新的蛋白因子与HBV病毒入侵、感染的相关性研究；完成体内外验证HBx蛋白和细胞蛋白的相互作用研究。建立中国旱獭嗜肝病毒急、慢性感染模型，研究旱獭WHV感染的传代和传播机制； 完成MHV-3所致重症肝炎炎性反应影响的工作。2007年12月-2008年11月在对HBV基因型重组体序

31、列分析基础上，建立简便准确的HBV基因型重组体鉴定方法；通过综合评价，选择一个或几个合适的细胞系作为研究HBV的分子生物学和药物的筛选的平台。研究与HBV病毒复制、转录、病毒颗粒装配相关的基因在HBV病毒生活周期中的功能；用蛋白质组学的方法，鉴定与HBV相关的细胞蛋白，针对相应的蛋白研究其在HBV病毒入侵、感染中的作用；完成对血清和肝组织中旱獭肝炎病毒蛋白和核酸进行检测，建立WHV感染特异性血清学检测方法；完成探讨Tr对MHV-3抗原特异性CD8+细胞的抑制作用和参与的细胞因子及途径。初步确定参与Tr 包括DN Tr对MHV-3抗原特异性CD8+细胞抑制作用的分子及其调控机制。2008年12月

32、-2009年11月对HBV基因型及重组体与临床疾病谱以及病理学改变的关系加以深入系统的研究；完成“野生CTL表位”和“变异CTL表位”免疫优势差异的体外分析比较；利用杆状病毒能转导不同的肝细胞，获得HBV的复制和基因的表达信息；完成测定不同HCV功能基因对HBV的复制与表达的影响，得出不同HCV功能基因对HBV感染影响、HCV和HBV混合感染的相互影响的综合评价；建立噬菌体肝细胞表达蛋白、随机展示文库，筛选与不同HBV表面抗原、病毒颗粒的结合肽； 完成在Hep G2.2.1.5细胞中超表达HBx蛋白和相应蛋白后，用ELISA方法测定培养液中的HBeAg和HBsAg的水平，或者用定量PCR技术测

33、定病毒粒子的影响的研究；完成超表达或者抑制表达与HBx相互作用细胞蛋白的细胞和肝癌细胞注射裸鼠，观察注射部位肿瘤生成情况的研究；完成旱獭WHV感染的自然史以及WHV在旱獭体内适应性变异和自发性变异特点的研究；初步完成嗜肝病毒感染发病机制的研究，阐明参与病毒清除和致免疫病理损伤的效应分子；进行抗病毒治疗和免疫预防新策略的研究，探索抗病毒治疗与免疫调节治疗的有效联合与序贯给药策略。初步完成嗜肝病毒感染致肿瘤机制研究，阐明嗜肝病毒感染导致肝脏肿瘤发生的分子机制。2009年12月-2010年11月对HBV基因型重组体作进一步分析，体外构建各种可能有意义的重组体，使用体外转染及表达技术等对其病毒学特点进

34、行研究； 完成“宿主免疫遗传学特征HBV感染与免疫”的内在关联及意义的分析工作；建立HBV重组杆状病毒感染不同肝细胞以后基因表达谱差异显示数据库；完成与HBV病毒复制、转录、病毒颗粒装配相关的基因在HBV病毒生活周期中的功能的研究工作；进行在实验动物水平HBx蛋白及其相互作用蛋白的功能性研究。阐明特异性Tr细胞包括DN Tr是否参与HBV所致重症肝炎炎性反应的免疫调节作用；建立不同临床类型乙型肝炎患者（包括健康人群）T细胞亚群克隆； 阐明特异性Tr对HBV抗原特异性CD8+细胞抑制作用的分子及调控机制。鉴定参与HBV抗原特异性CD8+细胞抑制作用的重要新分子，阐明其调控机制。二.乙型肝炎病毒变

35、异及与宿主相互作用的分子与免疫机制200512-2006121不同临床类型、病毒学指标和病理背景的不同HBV感染病例的收集及免疫学研究；2. 持续表达HBsAg转基因鼠及稳定表达HBsAg细胞系的验证;3. 在细胞系统中研究乙型肝炎病毒与干扰素的相互作用;2007.1-2007.121. 治疗性乙肝疫苗（乙克）治疗过程中免疫学功能的研究;2. 持续表达HBsAg转基因鼠及稳定表达HBsAg细胞系的基因组学研究;3. 慢性乙肝患者与急性甲型肝炎病人和正常人体内-干扰素及相关因子表达水平与病毒感染转归关系的研究；2008.1-2008.121. 预防疫苗无应答人群免疫学的研究;2. 持续表达HBs

36、Ag转基因鼠及稳定表达HBsAg细胞系的蛋白组学研究;3. 比较有无乙肝病毒存在下干扰素诱导的细胞蛋白表达的变化揭示乙肝病毒在细胞内基因复制和蛋白表达对干扰素相关信号通路的影响；2009.1-2010.111. 进一步在动物模型中验证机体免疫与疾病发生和转归的关系;2. 构建相应的能适应稳定表达HBsAg模型的功能基因组数据库,并对关键分子进行研究;3. 研究干扰素等作用下诱生的细胞基因尤其是抗病毒效应基因表达的变化,了解新发现的细胞基因在抗病毒及信号传导途径中的作用.三、艾滋病毒变异与流行和致病及免疫机制的研究1、HIV变异及与致病性关系的研究年度 研究内容20062007200820092

37、010新发感染队列的HIV基因变异特征与规律长期不进展者与慢性感染队列HIV基因变异特征与疾病病程及转归的关系病毒变异与病毒嗜性和复制能力的关系病毒变异与致病力的关系2、抗HIV的免疫反应影响HIV致病性的研究年度 研究内容20062007200820092010蛋白特异性单克隆抗体的筛选和中和抗体特性的研究粘膜上皮细胞与HIV相互作用的研究及IgA抗病毒功能研究免疫保护、病毒逃逸与疾病进展的研究侵染性克隆和猴模型的建立和分析分析免疫细胞的功能缺失及发生的时间阐明上皮细胞、树突状细胞和淋巴细胞在粘膜传播和粘膜保护中的作用。3、病毒/宿主相互作用及病毒超感染影响HIV致病性的研究年度 研究内容2

38、0062007200820092010HIV LTR启动子功能调节的研究宿主蛋白质修饰及对HIV基因表达的影响细胞因子与HIV Tat或Rev的相互作用gp41构象变化及内吞和出芽的分子机制预计每年在国际著名期刊发表高水平研究论文4-6篇，年度总SCI影响因子不低于12分（后2年不低于15分）。预计课题后3年每年申报专利1-3项，申报省部级科技奖励1-2项。四、重要肠道菌毒力岛、致病基因调控与系统生物学研究2005.122006.11构建OI28岛和OI172岛各组成基因的缺失突变体；建立模拟体内外环境培养痢疾杆菌的稳定条件，以及制备一致性良好的RNA和蛋白质样品；利用毒力岛芯片筛查已知各类肠

39、道菌属中毒力岛分布状况。2006.122007.11利用细胞和动物模型评价上述缺失突变体和野生株间致病表型的差异；利用基因芯片和比较蛋白质组学技术筛选不同培养条件下痢疾杆菌差异表达的基因或蛋白；利用毒力岛芯片筛查传染病流行中不同分离株的毒力岛分布状况。2007.122008.11借助芯片技术从RNA表达上观察各缺失突变体对其他毒力岛及毒力基因表达的影响，利用比较蛋白质组筛选缺失突变株差异表达的蛋白；对不同培养条件下获得的差异表达蛋白或基因进行克隆表达以及构建相应的突变体，并利用细胞和动物模型评价它们的功能；利用毒力岛芯片检测未知病原菌的毒力岛，了解其毒力岛的携带状况。2008.122009.1

40、1综合分析，确定OI28/OI172岛的作用及其功能蛋白；综合分析不同的培养条件和相应差异表达的基因及其缺失和过表达所造成的对其他基因和菌株本身的影响，建立痢疾杆菌可能的致病调控途径，进一步阐述其致病机理；综合不同来源菌株毒力岛的信息，了解并掌握肠道菌中毒力岛的分布及水平传播的规律，推测肠道病原菌毒力进化的可能机制,解释毒力岛与细菌变异及传染病流行间的关系,从而为确定新病原并解释其发生机理和可能的致病机制提供依据。2009.122010.11筛查其它大肠杆菌菌株是否具有OI28岛等毒力岛、基因组岛，以及进一步评价它们的功能，评价其是否能够发展成为新的病原菌的可能性；通过差异表达蛋白或基因的筛选

41、及其表达调控的分析，进一步评价它们在疫苗研制和抗微生物药物筛选上应用的可能性；在完成志贺氏菌属不同群代表株以及EIEC等重要肠道病原菌的全基因组序列的基础上，制备生物芯片，利用生物信息学及生物芯片技术对重要肠道病原菌（包括动物肠道病原菌）基因组结构与差异进行扫描与分析。结合功能基因研究方法研究重要肠道病原菌基因组结构与差异及其差异与生物学性状等的关系以及重要动物肠道病原菌基因组成。同时认识重要肠道病原菌（包括动物肠道病原菌）的系统进化关系，为阐明不同物种肠道病原菌结构与功能差异对于肠道致病菌的致病机制、进化变异规律（跨物种传播）具有重要的理论和实际意义。五.新病原微生物分离与鉴定待进一步论证后提出。