1、 申请代码 H0217 受理部门 收件日期 受理编号 解除保护 国家自然科学基金国家自然科学基金 申申 请请 书书 (2 0 1(2 0 1 1 1 版版)资助类别：面上项目 亚类说明：附注说明：项目名称：钙敏感受体调控内源性 H2S 抑制糖尿病血管平滑肌细胞增殖的研究 申 请 人：张伟华 电话：451-86699587 依托单位：哈尔滨医科大学 通讯地址：黑龙江省哈尔滨市南岗区保健路 157 号 邮政编码：150086 单位电话：045186669470 电子邮箱： 申报日期：2011年2月28日 国家自然科学基金委员会 国家自然科学基金申请书 2011 版 第 2 页 版本 1.017.5
2、51 基本信息基本信息 ykKr4oHP 申申 请请 人人 信信 息息 姓名 张伟华 性别 女 出生 年月 1972 年 1 月 民 族 汉族 学位 博士 职称 教授 每年工作时间（月）10 电话 451-86699587 电子邮箱 传真 国别或地区 中国 个 人 通 讯 地 址 黑龙江省哈尔滨市南岗区保健路 157 号 工作单位 哈尔滨医科大学/基础医学院 主 要 研 究 领 域 糖尿病心血管病、心肌缺血再灌注损伤 依托单位信息依托单位信息 名称 哈尔滨医科大学 联系人 刘心平 电子邮箱 电话 045186669470 网站地址 http:/61.158.20.195/合作研究单位信息合作研
3、究单位信息 单 位 名 称 在此录入修改 在此录入修改 项项 目目 基基 本本 信信 息息 项目名称 钙敏感受体调控内源性H2S抑制糖尿病血管平滑肌细胞增殖的研究 资助类别 面上项目 亚 类 说 明 附注说明 申请代码 H0217:周围血管疾病 H0713:糖尿病 基地类别 研究期限 2012 年 1 月 2015 年 12 月 研究属性 应用基础研究 申请经费 70.0000 万元 摘摘 要要 (限限 400400 字字)：糖尿病血管平滑肌细胞(VSMC)增殖在动脉粥样硬化形成中起重要作用，但机制不详。VSMC 通过胱硫醚-裂解酶（CSE）催化产生信号气体分子H2S,后者可抑制 VSMC增殖
4、。我们研究显示，细胞内钙通过钙调蛋白与 CSE 的相互作用调控内源性 H2S 的产生，但具体的调控机制尚不清楚。本课题组已证实，钙敏感受体（CaR）作为 G 蛋白偶联受体可引起细胞内钙增加。在预实验中，我们发现：高糖培养 72 小时后，VSMC 的 CaR 和 CSE 表达明显降低；激活 CaR 可使 CSE 表达上调。因此，我们推测“CaR 表达下调使内质网释放 Ca2+减少、CSE 活性下降，导致内源 H2S 生成减少”是糖尿病平滑肌增殖的新机制。我们拟制备 CSE敲除鼠和野生鼠的糖尿病动物模型和高糖细胞模型，应用 siRNA，CSE 转染、基因芯片、免疫共沉淀等技术，从整体-血管环-细胞
5、层次证明我们的假说。此研究将为糖尿病性动脉粥样硬化的防治提供新思路和新靶点。关关 键键 词词(用分号分开，最多 5 个)糖尿病；钙敏感受体（CaR）；胱硫醚-裂解酶（CSE）；H2S;血管平滑肌细胞 国家自然科学基金申请书 2011 版 第 3 页 版本 1.017.551 项目组主要项目组主要参与者参与者（注:项目组主要参与者不包括项目申请人）编号 姓 名 出生年月 性别 职 称 学 位 单位名称 电话 电子邮箱 项目分工 每年工作时间（月）1 杨广东 1972-6-16 男 副教授 博士 Lakehead University 001-346-7857 gyanglakeheadu.ca
6、理论指导 3 2 董世云 1986-2-12 女 博士生 硕士 哈尔滨医科大学 0451-86699587 模型制备分子生物学 10 3 钟鑫 1974-11-17 男 博士生 硕士 哈尔滨医科大学 0451-86699587 质粒构建、转染 6 4 胡光霞 1982-10-11 女 硕士生 学士 哈尔滨医科大学 451-86699587 蛋白分析增值检测 10 5 王雷红 1985-12-30 女 硕士生 学士 哈尔滨医科大学 451-86699587 H2S 检测细胞生物学 10 6 刘莉 1957-11-3 女 实验师 学士 哈尔滨医科大学 451-86699587 参与实验建立 9 7
7、 在此录入修改 8 在此录入修改 9 在此录入修改 总人数 高级 中级 初级 博士后 博士生 硕士生 7 2 1 2 2 说明:高级、中级、初级、博士后、博士生、硕士生人员数由申请人负责填报（含申请人），总人数由各分项自动加和产生。国家自然科学基金申请书 2011 版 第 4 页 版本 1.017.551 经费申请表经费申请表 （金额单位：万元）科目 申请经费 备注（计算依据与说明）一一.研究经费研究经费 55.5000 1.科研业务费 8.0000 （1）测试/计算/分析费 2.0000 细胞周期、细胞内钙的检测（2）能源/动力费 2.0000 水电费（3）会议费/差旅费 2.0000 2
8、人参加会议的会务费和差旅费（4）出版物/文献/信息传播费 2.0000 发表 SCI 和核心期刊文章的版面费、复印费、查新费（5）其他 2.实验材料费 47.5000 （1）原材料/试剂/药品购置费 40.5000 主要包括化学试剂，cDNA 合成试剂，RT-PCR 试剂，抗体以及各种检测试剂盒（2）其他 7.0000 购买实验动物 3.仪器设备费 0.0000 （1）购置 （2）试制 4.实验室改装费 5.协作费 二二.国际合作与交流费国际合作与交流费 6.0000 1.项目组成员出国合作交流 4.0000 1 人参加国际会议的会务费及旅差费 2.境外专家来华合作交流 2.0000 一名境外
9、专家来华的差旅费 三三.劳务费劳务费 5.0000 直接参加项目研究的研究生、博士后人员的劳务费 四四.管理费管理费 3.5000 5%管理费 合合 计计 70.0000 与本项目相关的 其他经费来源 国家其他计划资助经费 其他经费资助（含部门匹配）其他经费来源合计其他经费来源合计 0.0000 国家自然科学基金申请书 2011 版 第 5 页 申请者在撰写报告正文时，请遵照以下要求：1、请先选定项目基本信息中的资助类别，再填写报告正文；2、在撰写过程中，不得删除系统已生成的撰写提纲（如误删可点击“查看报告正文撰写提纲”按钮，通过复制/粘贴恢复）；3、请将每部分内容填写在提纲下留出的空白区域处
10、；4、本要求将作为申请书正文撰写是否规范的评判依据，请遵照要求填写。查看报告正文撰写提纲 报告正文报告正文（一）立项依据与研究内容（4000-8000 字）：1.项目的立项依据（研究意义、国内外研究现状及发展劢态分析，需结合科学研究发展趋势来论述科学意义。附主要参考文献目录）1、项目的立项依据 糖尿病(diabetes mellitus,DM)是严重危害人类健康的全身性代谢疾病,常发生血液流变学、微循环和细胞代谢的紊乱,导致缺血、缺氧和组织水肿,进而引起血管和神经病变。血管病变常常是糖尿病病人致死，致残的主要原因1。平滑肌细胞的增殖是糖尿病引发动脉粥样硬化性疾病的显著特征。本课题将探讨糖尿病血
11、管平滑肌细胞增殖的可能机制，以便为糖尿病和动脉粥样硬化性疾病的防治提供新思路与新靶点。最近的研究表明，糖尿病平滑肌细胞的增殖不仅可引起血管壁的增厚和管腔的狭窄，而且通过一些级联反应最终导致动脉粥样硬化的发生（见下图1）2。血管平滑肌细胞增殖？小动脉管壁变厚 小动脉管腔变窄、脂质堆高糖 ROS 大量形成 NO 合成减少 Ox-LDL 增多 图图1 1 高糖作用下动脉粥样硬化形成高糖作用下动脉粥样硬化形成示意图示意图 血管内皮细胞 血管平滑肌细胞 国家自然科学基金申请书 2011 版 第 6 页 在正常情况下，血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）的功能
12、以收缩为主。在高糖作用下，VSMC发生可逆性表型及其相应基因的转变，导致细胞内蛋白合成活跃，VSMC 明显发生增殖而收缩功能下降2。在在糖尿病诱发糖尿病诱发动脉粥样硬化的动脉粥样硬化的过程中，平滑肌细胞的增殖起关键过程中，平滑肌细胞的增殖起关键作用。作用。但是，但是，糖尿病糖尿病平滑肌细胞增殖的机制十分复杂，平滑肌细胞增殖的机制十分复杂，迄今尚不迄今尚不清楚清楚。一般认为，糖尿病病人血管内皮细胞中eNOS的表达减少，对内源性NO的血管舒张反应消失，可能是血管平滑肌增生的重要机制之一3。还有在糖尿病动物模型中发现，某些生长因子如血管内皮生长因子（vascular endothelial grow
13、th factor，VEGF）和转化生长因子-（transforming growth factor-，TGF-）等表达上调，促进平滑肌的增殖。最新研究提示，糖尿病模型中舒血管物质表达减少在调节血管平滑肌细胞表型转化及增殖中起重要作用2,4。继NO和CO之后，H2S（hydrogen sulfide，H2S）是新发现的一种内源性气体信号分子。硫化氢具有许多与NO相似的生理功能，例如，扩血管、促凋亡和抑增殖等5,6。内源性H2S 是机体多种细胞在半胱氨酸在胱硫醚-合成酶（cystathionine-synthase，CBS）、胱硫醚-裂解酶（cystathionine-lyase，CSE）和半胱
14、氨酸转移酶催化作用下产生。上述三种关键酶在体内的分布不尽相同：神经系统内主要存在CBS，而没有CSE；回肠、肝脏以及肾脏同时存在CBS和CSE；血管平滑肌则只有CSE表达而无CBS7,8。H2S的重要生物学效应是调节细胞的增殖和凋亡10,11。有研究报道，H2S 参与了血管平滑肌细胞、血管内皮细胞、心肌细胞、神经细胞、胰腺腺泡细胞等的增殖和凋亡的调控9-11，在心血管、神经、内分泌、消化、呼吸等系统，H2S主要表现为抑制增殖。H2S 对细胞凋亡的调节较复杂，例如，生理浓度H2S可抑制结肠上皮细胞的凋亡，但可诱导血管平滑肌细胞凋亡12,13。目前研究表明，内源性 H2S 广泛存在于心血管系统组织
15、中,可调节心肌舒缩功能,舒张体循环和肺循环的血管,抑制血管平滑肌细胞增殖并调控其表型转化12,14。我们我们最最先进行了先进行了内源性内源性 H2S 生成生成调控调控机制机制的研究的研究。2008 年，本课题组年，本课题组的的主要成员主要成员 Guangdong Yang 发现发现，血管内皮细胞中游离钙增加可通过，血管内皮细胞中游离钙增加可通过钙调蛋白钙调蛋白（calmodulin，CaM）与与 CSE（H2S 生成关键酶生成关键酶）相互作用，激活相互作用，激活 CSE，进，进而使而使 H2S 产生增多（产生增多（Science.2008,322:587-90）10；2010 年进一步年进一步
16、证实证实，CSE 的的高表达可高表达可抑制平滑肌抑制平滑肌增殖增殖和诱导凋亡，和诱导凋亡，国家自然科学基金申请书 2011 版 第 7 页 敲除敲除 CSE 基因基因小鼠小鼠血管平滑肌细胞血管平滑肌细胞则出现则出现明显增殖明显增殖26。钙敏感受体（calcium sensing receptor,CaR）是 G蛋白偶联受体家族中 C 家族成员。CaR 主要分布在甲状旁腺、肾脏、胃肠道、骨组织以及其他细胞如胎盘、晶状体、乳腺、胰腺 细胞等。细胞外钙是第一个被确认的通过激活 CaR 而起作用的物质15。Ca2+既是第一信使，又起第二信使的作用，细胞外钙（第一信使）与细胞膜上的 CaR 结合，生成
17、DAG（二脂酰甘油）和 IP3（肌醇-1，4，5-三磷酸）。当 IP3从膜上扩散到细胞浆中，与肌浆网上的 IP3受体结合，引起肌浆网钙库内的 Ca2+释放，使细胞内的 Ca2+浓度升高（第二信使）（见图 2）。CaR 除了在调节机体钙稳态中起重要作用，还具有其它功能，如调节细胞增殖、分化、凋亡、激素的分泌等16,17。图图 2 2 CaR 引起细胞内钙释放的示意图引起细胞内钙释放的示意图 （Aldebarab M.Hofer Cell Calcium 2004,35:297-307）最新研究表明，人冠状动脉和大鼠肠系膜动脉均有CaR的表达，CaR激动剂可引起肠系膜动脉舒张18。但是，CaR调控
18、血管平滑肌舒缩的机制尚不清楚。在预实验中，我们发现我们发现小鼠小鼠肠系膜动脉血管平滑肌细胞中有肠系膜动脉血管平滑肌细胞中有CaR表表达，激动达，激动CaRCaR可可引起细胞内钙引起细胞内钙增加增加。另外，我们还观察到，我们还观察到，25mM葡萄糖葡萄糖作用作用72小时小时可使可使小鼠肠系膜动脉平小鼠肠系膜动脉平滑肌细胞滑肌细胞CaR表表达明显达明显降降低低（见见 工作基础工作基础 图图6）。综上所述，我们推测我们推测肠系膜动脉平滑肌细胞肠系膜动脉平滑肌细胞CaRCaR表表达下达下降与糖尿病阻力血管早期的细胞增殖有关。降与糖尿病阻力血管早期的细胞增殖有关。尽管国内外学者在心血管系统CaR方面开展
19、了一些研究19,20，但是，CaR是否是否参与参与内源性内源性H2S的的调控调控迄今未见报道。迄今未见报道。新近的研究发现，细胞 Ca2+调控异常参与动脉粥样硬化的平滑肌细胞增殖的发生发展21。我们的前期工作证实，在心肌细胞中我们的前期工作证实，在心肌细胞中 CaR 可通过可通过激活激活 PLC-IP3通路通路引起内质引起内质网释放网释放 Ca2+，进而，进而增加细胞内钙增加细胞内钙22,23。此外，细胞内钙的增加，可活化 CaM 的活性，国家自然科学基金申请书 2011 版 第 8 页 其调控多种生理功能。在心血管系统中，在心血管系统中，Ca2+/CaM 可调节可调节 CSE 的活性，进而调
20、控的活性，进而调控 H2S的生成，最终影响血管平滑肌的张力、增殖和的生成，最终影响血管平滑肌的张力、增殖和细胞凋亡细胞凋亡24,25。基于上述分析并结合预实验结果，我们我们提出以下假设：提出以下假设：糖尿病糖尿病血管平滑肌血管平滑肌 CaR 的表达下调的表达下调，使，使内质网释放内质网释放CaCa2+减少，对减少，对 CaM 的的活化作用减低，引起活化作用减低，引起 CSE 活性活性降低降低，导致，导致内源性内源性 H2S 生成的减少，生成的减少，从而促进血管平滑肌细胞的增殖（见图从而促进血管平滑肌细胞的增殖（见图3）。图图 3 3 本课题假设示意图本课题假设示意图 本课题拟制备 CSE 敲除
21、鼠和野生鼠的糖尿病动物模型和细胞模型（高糖），应用siRNA，CSE 转染、基因芯片、免疫共沉淀等技术，从整体-血管环-细胞层次证明我们的假说。本研究的顺利实施，将为糖尿病性动脉粥样硬化的防治提供新思路和新靶点。参考文献参考文献 1.Soon Jun Hong,Sung Tae Kim,Tae-Jin Kim,Eun-Ok Kim,Chul-Min Ahn,Jae Hyoung Park,Sang Kim,Kyung-Mi Lee,Do-Sun Lim Cellular and Molecular Changes Associated With InhibitoryEffect of Piog
22、litazone on Neointimal Growth in Patients With Type 2 Diabetes After Zotarolimus-Eluting Stent Implantation Arterioscler Thromb Vasc Biol 2010;30;2655-2665 2.Gueguen M,Keuylian Z,Mateo V,Mougenot N,Lompre AM,Michel JB,et al.Implication of adenylyl cyclase in pathological smooth muscle cell migration
23、 occurring in rat and human vascular remodelling.The cystathionine-lyase(CSE)?Calcium sensing receptor(CaR)Calmodulin（CaM）?H2S Proliferation 高糖环境高糖环境 国家自然科学基金申请书 2011 版 第 9 页 Journal of pathology.Jul 2010;221(3):33142.3.陈玉堂，田慧 糖尿病合并高血压对微血管病变患病率的影响 中华内分泌代谢杂志2008，14（2）106-108 4.沈征,钱凯先,严庆丰,张曙云 糖尿病引发相关组
24、织细胞异常凋亡病变之综述 浙江大学学报 2004，11；1501-1503 5.Kimura H.Hydrogen sulfide:its production,release and functions.Amino Acids 2010;DOI:10.1007/s00726-010-0510-x.6.Papapetropoulos A,Pyriochou A,Altaany Z,Yang G,Marazioti A,Zhou Z,Jeschke MG,Branski LK,Herndon DN,Wang R,Szab C.Hydrogen sulfide is an endogenous s
25、timulator of angiogenesis.Proc Natl Acad Sci U S A 2009;106(51):21972-21977.7.Du JB,Tang CS.Study on hydrogen sulfide as a gasotransmitter:from bench to bedside.Nat Med J Chin(中华医学杂志)2008;88(32):2233-2234(Chinese).8.Calvert JW,Coetzee WA,Lefer DJ.Novel insights into hydrogen sulfide-mediated cytopro
26、tection.Antioxid Redox Signal2010;12(10):1203-1217.4 9.Tang G,Wu L,Wang R.Interaction of hydrogen sulfide with ion channels.Clin Exp Pharmacol Physiol 2010;37(7):753-763 10.Yang G,Wu L,Jiang B,Yang W,Qi J,Cao K,Meng Q,Mustafa AK,Mu W,Zhang S,Snyder SH,Wang R.H2S as a physiologic vasorelaxant:hyperte
27、nsion in mice with deletion of cystathionine gamma-lyase.Science.2008,322:587-90 11.Yang G,Wu L,Bryan S,Khaper N,Mani S,Wang R.Cystathionine gamma-lyase deficiency and overproliferation of smooth muscle cells.Cardiovasc Res.2010 Jun 1;86(3):487-95.12.Yang G,Wu L,and Wang R.H2S,endoplasmic reticulum
28、stress,and apoptosis of insulin-secreting beta cells.J.Biol.Chem.2007,282:16567-76 13.Yang W,Yang G,Jia X,Wu L,Wang R.Activation of KATP channels by H2S in rat insulin-secreting cells and the underlying mechanisms.J Physiol(Lond)2005;569(2):519-531.14.S.K.Yan,T.Chang,H.Wang,L.Wu,R.Wang,Q.H.Meng,Effe
29、cts of hydrogen sulfide on homocysteine-induced oxidative stress in vascular smooth muscle cells,Biochem.Biophys.Res.Commun.351(2006)485491 15.Li,X.,Zima,A.V.,Sheikh,F.,Blatter,L.A.,and Chen,J.Endothelin-1-induced arrhythmogenicCa2+signaling is abolished in atrial myocytes of inositol-1,4,5-trisphos
30、phate(IP3)-receptor type 2-deficient mice.国家自然科学基金申请书 2011 版 第 10 页 Circ.Res.2005.96:12741281.16.Wenhan Chang,Dolores Shoback Extracellular Ca2+-sensing receptorsan overview Cell Calcium 2004，35：183196 17.K.D.Garcia,T.Shah,J.Garcia,Immunolocalization of type 2 inositol 1,4,5-trisphosphate receptors
31、in cardiac myocytes from newborn mice Am.J.Physiol.Cell Physiol.287(2004)C1048C1057.18.Weston AH,Absi M,Harno E.The expression of function of Ca(2+)sensing receptor in rat messenteric artery:comparative studies using a model of type II diabetes Br.J.Pharmacol 2008;154:652-662 19.Joshua J.Martindale,
32、Rayne Fernandez,Donna Thuerauf,Ross Whittaker,Natalie Gude,Endoplasmic Reticulum Stress Gene Induction and Protection From Ischemia/Reperfusion Injury in the Hearts of Transgenic Mice With a Tamoxifen-Regulated Form of ATF6 Circ.Res.2006;98;1186-1193.20.Sanela Smajilovic,Jacob Tfelt-Hansen Calcium a
33、cts as a first messenger through the calcium-sensing receptor in the cardiovascular system Cardiovascular Research 2007；75：457467.21.Nicolas Demaurex and Clark Distelhorst Apoptosisthe Calcium Connection SCIENCE 2003；300：65-67.22.Zhang WH,Fu SB,Lu FH,Wu B,Gong DM,Pan ZW,Lv YJ,Zhao YJ,Li QF,Wang R,Ya
34、ng BF,Xu CQ.Involvement of calcium sensing receptor in ischemia/reperfusion induced apoptosis in rat cardiomyocytes.Biochemical and Biophysical Research Communications 2006,347:872-881 23.Zhang WH,Lu FH,Zhao YJ,Wang LN,Tian Y,Pan ZW,Lv YJ,Wang YL,Du LJ,Sun ZR,Yang BF,Wang R,Xu CQ,Post-conditioning p
35、rotects rat cardiomyocytes via PKCe-mediated calcium-sensing receptors Biochemical and Biophysical Research Communications 2007,361:659-664 24.Zhao W,Wang R.H2S-induced vasorelaxant and the underlying cellular and molecular mechanisms.Am J Physiol Heart Circ Physiol 2002;283(2):H474-H480.25.Yang G,S
36、un X,Wang R.Hydrogen sulfide-induced apoptosis of human aorta smooth muscle cells via the activation of mitogen-activated protein kinases and caspase-3.FASEB J 2004;18:17824.26.Yang G,Wu L,Bryan S,Khaper N,Mani S,Wang R.Cystathionine gamma-lyase deficiency and overproliferation of smooth muscle cell
37、s.Cardiovasc Res.2010;86:487-95.国家自然科学基金申请书 2011 版 第 11 页 2.项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键科学问题。（此部分为重点阐述内容）2.1 研究内容研究内容 （1）糖尿病小鼠糖尿病小鼠 CaR、CSE 和内源性和内源性 H2S 的动态的动态变化变化对对血管血管张力的影响：张力的影响：检测糖尿病小鼠 CaR 与 CSE 的表达和内源性 H2S 含量的动态变化；观察野生型和敲除型 CSE 小鼠的糖尿病模型中不同造模时间时内源性 H2S 含量、肠系膜动脉张力和平滑肌细胞增殖的变化；（2）肠系膜动脉平滑肌细胞肠系膜动脉平滑肌细胞（mese
38、nteric artery smooth muscle cells,MA-SMCs）在高在高糖环境中糖环境中 CaR 表达的变化对表达的变化对 CSE 活性活性、H2S 生成和生成和增殖增殖的影响的影响及其机制及其机制:观察 MA-SMCs 在高糖环境下 CaR 和 CSE表达变化对内源性 H2S含量及细胞增殖的作用；进一步观察 MA-SMCs 在高糖环境下使用不同处理因素作用下，CaR 调控 CSE 表达的机制；（3）在在高糖环境中高糖环境中 CaR 调控调控 CSE 活性活性引起引起 MA-SMCs 的信号转导机制：的信号转导机制：观察高糖诱导的 CSE 表达下调对 HB-EGF 通路信号
39、分子表达的影响；观察 HB-EGF表达的变化如何通过 PI3K/AKT 和 MAPK通路参与 MA-SMCs 的增殖。2.2 研究目标研究目标 （1）揭示揭示糖糖尿病尿病模型中模型中 CaR 与与 CSE 动态动态表达表达变化对变化对 H2S 含量以及肠系膜动脉环张力含量以及肠系膜动脉环张力的影响。的影响。（2）阐明阐明 CaR 在在高糖高糖诱导诱导 CSE 活性活性改变改变和和动脉平滑肌细胞增殖动脉平滑肌细胞增殖中中的的作用和作用和机制。机制。（3）进一步阐明进一步阐明 CaR 调控调控 CSE 活性诱导平滑肌细胞增殖的活性诱导平滑肌细胞增殖的信号转导信号转导机制机制，以便为糖，以便为糖尿病
40、的防治提供新靶点尿病的防治提供新靶点。2.3 拟解决的关键问题拟解决的关键问题 理论理论上的上的关键问题：关键问题：国家自然科学基金申请书 2011 版 第 12 页 CSE 是 H2S 产生的关键酶，内源性 H2S 抑制平滑肌细胞增殖已有报道，但具体机制（信号转导通路）不详。本研究通过观察糖尿病时 CaR 的表达下调对 CSE 活性、H2S生成、细胞增殖和 HB-EGF及 PI3K/AKT及 MAPK 信号通路的影响，从基因、蛋白质和功能诸方面揭示糖尿病模型中动脉平滑肌细胞增殖的机制，具有重要的理论意义。技术关键问题：技术关键问题：(1)肠系膜动脉平滑肌细胞的分离和传代培养，本实验使用 2
41、代6 代的平滑肌细胞，保证其生物学特性的稳定。（2）本实验采取基因芯片技术，筛选 CSE 基因敲除小鼠中受 CSE 负调控的细胞增殖相关基因，并用 real-time PCR 技术对筛选出的基因定量。鉴于很多 mRNA 不能转录成功能蛋白质的事实，申请者从基因芯片提供的信息为线索，采用 Western blot 技术测定相关信号转导蛋白的表达变化。2.拟采取的研究方案及可行性分析。（包括有关方法、技术路线、实验手段、关键技术等说明）第一部分第一部分 糖尿病小鼠糖尿病小鼠 CaR、CSE 和内源性和内源性 H2S 的动态变化的动态变化对对 血管血管张力的影响张力的影响 研究方案：研究方案：本实验
42、利用 CSE 野生型和敲除型小鼠制备糖尿病模型作为实验对象（本课题组主要成员 Guangdong Yang所在的 Cardiovascular research Lab of Lakehead University已于 2004年成功构建了 CSE 基因敲除小鼠，已发表了多篇相关文章（作为第一作者发表于 Science的文章，见立项依据）。实验首先实验首先检测检测糖尿病糖尿病和正常小鼠和正常小鼠 CaR 与与 CSE 动态动态表达表达和和内源内源性性 H2S 的含量变化的含量变化；其次观察；其次观察野生型野生型和和敲除敲除型型 CSE 小鼠的小鼠的糖尿病糖尿病模型模型中不同中不同造模造模时间时
43、间肠系膜动脉中肠系膜动脉中 CaR 与与 CSE 表达变化对血管张力的影响表达变化对血管张力的影响；同时同时检测检测 CSE 野生型和敲除型野生型和敲除型糖尿病糖尿病小鼠小鼠在不同时间点内源性在不同时间点内源性 H2S 含量的含量的改变改变和肠系膜动脉和肠系膜动脉血管平滑肌细胞血管平滑肌细胞增殖的增殖的变化变化。整体水平上观察整体水平上观察在糖尿病模型中在糖尿病模型中 CaR 和和 CSE 的变化规律及其对的变化规律及其对内源性内源性 H2S 的含的含量量、肠系膜动脉张力和血管平滑肌细胞的增殖的影响，实验分为以下几组：肠系膜动脉张力和血管平滑肌细胞的增殖的影响，实验分为以下几组：1.非糖尿病非
44、糖尿病 CSE 野生型野生型对照组（对照组（n=32）:小鼠未施加任何处理因素。2.2.STZ 诱导诱导 CSE 野生型糖尿病组野生型糖尿病组(n=32)(n=32):STZ(购自 Sigma)尾静脉注射（35mg/Kg）连续 5 天，一周后开始检测血糖，每周一次，血糖持续升高证实模型制备成功。每 4 国家自然科学基金申请书 2011 版 第 13 页 周观察肠系膜动脉的相关指标。3.3.STZ 诱导诱导 CSE 野生型糖尿病野生型糖尿病+NaHS 组组(n=32):STZ(购自 Sigma)尾静脉注射（35mg/Kg）连续 5 天，一周后开始检测血糖，每周一次，血糖持续升高证实模型制备成功。
45、STZ 注射 5 天后，腹腔注射 NaHS(70mol/Kg体重/日)，每 4 周观察肠系膜动脉的相关指标。4.4.非糖尿病非糖尿病 CSE 敲除敲除型型小鼠小鼠（n=32）：CSE 敲除型小鼠由 Cardiovascular Research Lab of Lakehead University 提供，未施加任何处理因素。5.5.STZ 诱导诱导 CSE 敲除敲除型糖尿病组型糖尿病组(n=32)(n=32)：CSE 敲除型模型制备及观察指标与 STZ(链脲菌素)诱导 CSE 野生型糖尿病组一致。6.6.STZ 诱导诱导 CSE 敲除敲除型糖尿病型糖尿病+NaHS 组组(n=32)：CSE 敲
46、除型模型制备及观察指标与STZ 诱导 CSE 野生型糖尿病组一致,STZ 注射 5 天后，腹腔注射 NaHS(70mol/Kg体重/日)，每 4 周观察肠系膜动脉的相关指标。技术路线技术路线 1：糖尿病小鼠糖尿病小鼠 CaR、CSE 和内源性和内源性 H2S 的动态变化的动态变化对对血管血管张力的影响张力的影响 整 体 动 物 CSE野生型小鼠野生型小鼠 CSE 敲除敲除型小鼠型小鼠 国家自然科学基金申请书 2011 版 第 14 页 （本部分实验制备糖尿病模型及不同处理因素的观测指标（本部分实验制备糖尿病模型及不同处理因素的观测指标时间点分别为时间点分别为 4，8，12 和和 16 周）周）
47、第二第二部分部分 肠系膜动脉平滑肌细胞在高糖环境中肠系膜动脉平滑肌细胞在高糖环境中 CaR 表达的变化表达的变化 对对 CSE 活性活性、H2S 生成和增殖生成和增殖的影响的影响及其机制及其机制 研究方案：研究方案：本部分实验将阐明高糖处理平滑肌细胞 CaR 与 CSE 的表达改变对细胞周期及细胞增殖和其相关蛋白的影响。拟用 25mM 葡萄糖处理同时加入 CaR 激动剂、H2S 供体和pCSE 质粒转染组（内源性 H2S 增加），观察细胞周期及细胞增殖情况的变化；，利用Western blot 技术检测细胞周期相关蛋白（cyclin D1，p21）和增殖细胞核抗原（proliferation
48、cellular nuclear antigen，PCNA等）的表达变化。实验分成以下 7 组：1.正常对照未处理组：用 DMEM培养液，培养肠系膜动脉平滑肌细胞未施加任何处理因素。2.正常对照 CaR 激动剂组：用 DMEM培养液，培养肠系膜动脉平滑肌细胞 72 小时后，加入 10M 的 Calindol。3.正常对照硫氢化钠组：用 DMEM 培养液，培养肠系膜动脉平滑肌细胞 72 小时后，CaR的免的免疫荧疫荧光定光定位位 张 力 的 改 变张 力 的 改 变（给予给予 CaR 的的激 动 剂激 动 剂(10uM Calindol)和和 100 uMNaHS 血管环张力测血管环张力测定）定
49、）非糖尿病非糖尿病对照组对照组 STZ 诱导糖诱导糖尿病尿病组组 STZ 诱导糖诱导糖尿病尿病组组 非糖尿病组非糖尿病组 肠 系 膜肠 系 膜平 滑 肌平 滑 肌细 胞 的细 胞 的增殖增殖（BrdU法）法）STZ 诱导糖尿诱导糖尿病病+NaHS 组组 STZ 诱导糖尿诱导糖尿病病+NaHS 组组 平滑肌细胞平滑肌细胞PCNA，cyclin D1 的的表 达 变 化表 达 变 化（Western blot）H2S含含量 的量 的 变变化化（紫外（紫外分光法）分光法）CaR与与CSE 的表的表达 变 化达 变 化（Real-time PCR，Western blot）分离肠系膜动脉肠系膜动脉 国
50、家自然科学基金申请书 2011 版 第 15 页 加入 100M NaHS（H2S 供体）。4.25mM 葡萄糖处理组：用含有 25mM 葡萄糖的 DMEM培养液培养 72 小时，此组作为高糖阴性对照组。5.25mM 葡萄糖处理+CaR 激动剂组：含有 25mM 葡萄糖的 DMEM培养液培养肠系膜动脉平滑肌细胞 72小时，加入 10M 的 Calindol 后 24 小时观察技术路线中的相关指标。6.25mM 葡萄糖处理+pCSE 质粒转染组：用真核表达载体（pcDNA3.1）构建重组质粒，转染肠系膜动脉平滑肌细胞，过表达 CSE，24小时后，用含有 25mM 葡萄糖的 DMEM培养液培养肠系
