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早期肠道接种瘤胃细菌及其组分物对新生羔羊小肠黏膜免疫机制形成的影响.pdf

上传人:a****2 文档编号:3114027 上传时间:2024-01-20 格式:PDF 页数:13 大小:1.96MB
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资源描述

1、申请代码受理部门收件日期受理编号国家自然科学基金申请书(2011版)资助类别:面上项目亚类说明:附注说明:项目名称:申请人:电话:依托单位:通讯地址:邮政编码:单位电话:电子邮箱:申报日期:2011年3月6日国家自然科学基金委员会国家自然科学基金申请书2011版基本信息姓名性别男生年月民族申学位职称每年工作时间(月)请电话电子邮箱人传真国别或地区中国信个人通讯地址息工作单位主要研究领域依托单位名称联系人电子邮箱遭电话网站地址单位名称合作研究单位信息项目名称项资助类别亚类说明目附注说明基本申请代码信基地类别息研究期限2012年1月一2015年12月研究属性基础研究申请经费80.0000万元限40

2、字),本,项目基于肠道黏膜免疫的微生物刺激理论,针对相关研究者在早期补喂健康成年牛胃肠道细菌对新生犊牛及本课题组在早期补喂健康成年羊瘤胃液对新生羔羊健康与指生长所表现出的作用提出,拟进一步开展深入的研究。项目以新生羔羊为模型动物,以口服方式给新生羔羊补喂或接种健康诚年绵羊瘤胃液及其组分物,应用免疫组织化学等方法检测小肠各段中的上皮内淋巴细胞、IgA分泌细胞等免疫相关细胞数量,应用酶学方法测定小肠各段粘膜组织中的N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶等的活性;应用LI$A法测定小肠各段黏膜中的sIgA、L-2、IL-6等的含量。从细胞学、免疫效应分子等角度探究早期胃肠道接种要成年绵羊瘤胃液及其组分物对

3、新生羔羊小肠黏膜免疫的影响及其作用机理,进一步丰富新生羔羊、犊牛早期小肠黏膜免疫的相关基础理论;为通过日粮调控新生羔羊、犊牛肠道黏膜免疫应答、保证新生羔羊、犊牛胃肠道健康提供新思路。关健词佣分号分开,最多5个)新生羔羊;瘤胃细菌;肠道接种,小肠黏膜免疫第2页国家自然科学基金申请书2011版经费申请表(金额单位:万元)科目申请经费备注(计算依据与说明)一研究经费71.80001.科研业务费16.8000(1)测试/计算/分析费(2)能源/动力费5.5000实验室、试验羊场水电维持费用,租车费用等(3)会议费/差旅费4.0000项目组人员参加国内会议计8人次0.5万元/人次(4)出版物/文献/信息

4、传播费7.3000论文发表、专利申报、文献检索等(5)其他2.实验材料费53.0000(1)原材料/试剂/药品购置费共计宰杀360只羔羊350元/只=12.6万元:各种52.2000ELISA试剂盒等39万元(2)其他0.8000试验羊场相关试验期间设施购置3.仪器设备费0.0000(1)购置(2)试制4.实验室改装费5.协作费2.0000动物现场试验的利用,每年试验协作费0.5万元二.国际合作与交流费0.00001.项目组成员出国合作交流2.境外专家来华合作交流三劳务费4.2000研究生的劳务费四.管理费4.0000项目经费的5%合计80.0000国家其他计划资助经费与本项目相关的其他经费资

5、助(含部门匹配)其他经费来源其他经费来漂合计0.0000第4页国家自然科学基金申请书2011版申请者在撰写报告正文时,请遵照以下要求:1、请先选定项目基本信息中的资助类别,再填写报告正文:2、在撰写过程中,不得删除系统已生成的撰写提纲(如误删可点击“查看报告正文撰写提纲”按钮,通过复制/粘贴恢复):3、请将每部分内容填写在提纲下留出的空白区域处:4、本要求将作为申请书正文撰写是否规范的评判依据,请遵照要求填写。报告正文面上项目申请书撰写提纲(一)立项依据与研究内容(4000-8000字):1项目的立项依据(研究意义、国内外研究现状及发展动态分析,需结合科学研究发展趋势来论述科学意义;或结合国民

6、经济和社会发展中迫切需要解决的关键科技问题来论述其应用前景。附主要参考文献目录)1.1国内外有关小肠黏膜免疫的相关研究避展小肠黏膜免疫是新生(newbom)动物早期抵御胃肠道有害细菌的第一道重要防御屏障,它包括天然免疫(innateimmunity)和适应性免疫(adaptiveimmunity)。新生羔羊、犊牛等由于胎盘不能将母体的抗体通过血液转运到胎儿,羔羊、犊牛出生后的第一周内依靠初乳中的抗体,以被动免疫(passiveimmunity)的方式表现出对胃肠道的保护作用。但即便如此,初乳中的抗体物质浓度在分娩后3天内即急速下降(Fetcher等,1983),因此,新生羔羊、犊牛必须尽早建立

7、肠道粘膜免疫机制才能不断增强对肠道病原菌的抵御能力,以保持机体健康和各种机能的正常发育。大量研究表明,在小白鼠、大白鼠等试验动物及猪等单胃动物,出生后伴随初乳提供的被动免疫作用逐渐下降时,各种肠道微生物的有效定殖(colonization)是动物早期肠道粘膜免疫形成的重要刺激物(Cebra,1999)。用无菌动物(germ-free)如小白鼠、鸡等小型试验动物的研究表明,与正常饲养的动物相比,无菌动物肠道粘膜免疫、机体系统免疫形成的时间明显延后(Moreau等,1978);而且,当无菌动物年龄达到一定阶段时,即使给予与无菌动物同种或异种的动物肠道分离菌种(单一菌种或混合菌种),无菌动物肠道粘膜

8、免疫、机体系统免疫仍不能达到正常饲喂动物的水平(Otte等,2004)。这种现象可称为“小肠黏膜免疫应答形成的微生物刺激理论”肠道黏膜免疫应答必须维持稳衡(homeostasis)状态,过度的免疫应答不仅会造成肠道黏膜上皮细胞发生炎症反应,于肠道组织健康有害(Taniguchi等,2009);而且,也将增加免疫应答时免疫细胞分裂、各种免疫效应分子合成等所需的养分支出,对动物生长发育不利(Klasing,2004)。因此,机体的免疫应答反应不是越强烈越好。关于动物机体最适免疫应答反应的评价,Kogut(2009)第5页国家自然科学基金申请书2011版在系统研究后总结指出,一是测定动物对特定病原微

9、生物的免疫应答能力,二是取决于动物的年龄;动物机体并不需要持续的高免疫应答能力,动物肠道的天然免疫、适应性免疫均能以特定的方式通过日粮进行调节,因而,调节动物免疫应答反应的关键控制点有两个:一是动物出生后的一段时间内(如出生后1周内),二是动物断奶前、后的一段时间。1.2国内外有关羔羊、犊牛小肠黏膜免疫研究的概述国内外有关羔羊、犊牛小肠黏膜免疫应答及其影响因素的相关研究报道十分有限,仅有的研究报道主要是围绕小肠黏膜免疫随动物年龄的变化关系展开。Porter等(1972)通过空肠中段安装瘘管技术研究了出生后2-6周龄犊牛在哺乳方式下小肠黏膜分泌免疫球蛋白的变化规律,。结果表明,在分泌的球蛋白中有

10、IgA、sIgA(分泌型IgA)和IgM存在,且IgM的含量显著高于IgA、sIgA的含量,尽管分泌液中含有IgG,但含量极低,由于当时没有较合适的定量方法,研究者并没对犊牛小肠分泌液中各种免疫球蛋白含量随年龄的变化规律及其影响因素进行系统的研究。在随后进行的犊牛小肠黏膜免疫的细胞学基础研究中,Allen等(1975)发现,哺乳犊牛小肠的十二指肠段、空肠段、回肠段黏膜中,合成IgA的细胞数均远远高于合成IgM、IgG的细胞数。现已明确,小肠黏膜分泌液中的IgA、sIgA和IgM是动物出生后早期黏膜免疫应答的重要效应分子,在调节肠道中微生物的定殖、抵抗有害肠道微生物侵袭等生物学作用中发挥重要作用

11、;尽管出生后动物血清中含有很高浓度的IgG,但参与黏膜免疫应答的作用很有限。中国农业大学陈耀星研究小组研究了不同日龄新生犊牛(1日龄和20日龄)、不同月龄犊牛(1月龄、4月龄、6月龄)、不同月龄山羊(0.5月龄、2月龄和12月龄)的小肠黏膜上皮内淋巴细胞、杯状细胞和肥大细胞等免疫相关细胞的分布和数量的变化规律(陈付菊等,2007a;宋恩亮等,2007;陈付菊等,2007b),为进一步认识犊牛、羔羊小肠黏膜免疫随年龄的变化提供了详实的数据资料。羔羊、犊牛等从出生至断奶,是动物一生中最为关键的时期。在这一时期内,如果饲养管理不当,羔羊、犊牛极易发生腹泻,不仅阻碍动物生长,更为严重的是将导致羔羊、犊

12、牛的高发病率高死亡率,给养殖者带来很大经济损失。据美国农业部1991年统计,奶犊牛从出生至断奶的死亡率超过10%,其中约50%是与动物没有获得足够的被动免疫有关。饲用抗生素类被禁止作为饲料添加使用后,更多的研究者寻求通过添加益生素类(proboitics)(或称为直接饲用微生物,direct-fed microbials;或称为微生态制剂)来改善动物健康、提高生产性能(Krehbiel等,2003)。在总结许多研究报道后,Krehbiel等(2003)提出,对出生至断奶阶段的羔羊、犊牛,饲养管理的首要目标是减少发病率死亡率,保证动物健康和正常的生长发育,其次才是生产性能指标(如增效和饲料效率等

13、)的改善,因而,包括益生素类添加剂等在内的许多调节物质首先应能使幼龄羔羊、犊牛建立并保持正常的胃肠道微生物种群结构和数量。在正常饲养条件下,羔羊、犊牛小肠中的微生物是逐渐形成的,其种群结构、数量随着哺乳到采食固体饲料再到反刍而处于一种动态变化之中。添加各种益生菌对反刍前羔羊、犊牛生产性能健康(如腹泻)等影响的相关报道近年来越来越多,但是,羔羊、犊牛出生后在第一次喂给初乳的同时或出生后24小时内时就补充微生物或其破碎成分的相关研究很少。长期以来,研究者大多偏重于对瘤胃微生物营养价值的研究,很少注意到瘤胃液或瘤胃细菌及其组分对新生羔羊、犊牛等机体免疫方面的可能作用第6页国家自然科学基金申请书201

14、1版James等(1976)从安装有十二指肠瘘管的健康哺乳期犊牛采集十二指肠液,在犊牛出生后第一次喂给初乳的同时,给试验组犊牛一次性补喂200ml采集制备的十二指肠液,一组犊牛在12小时、另一组犊牛在24小时后分别灌喂每ml含10个大肠杆菌(694菌株)的培养液50ml,试验显示,未补喂十二指肠液的对照组犊牛在灌喂大肠杆菌培养液后的10-18小时就出现严重腹泻,而试验组在第3天才出现间歇性的腹泻,且持续时间明显缩短;在7天的试验期内,12小时后补喂组的平均日增重为0.25kg,比对照组的0.11kg提高了127%,而24小时后补喂组的平均日增重为0.58kg,比对照组的0.18kg提高了222

15、%。Muscato等(2002)在犊牛出生后第一次喂给初乳的同时,补喂8ml健康奶牛新鲜瘤胃液,或经灭菌处理的瘤胃液,或离心后的瘤胃液上清液,或瘤胃液离心后的沉淀物悬浮液,初乳停喂后每天仍补喂8ml的各种制剂,试验结果显示,与对照组相比,试验组犊牛的腹泻天数都显著缩短;在6周的试验期内,各试验组02周的体增重都显著提高。由于各种补喂制剂中能提供的养分数量有限,因此,研究者推测是由于各种制剂中含有可调节犊牛小肠黏膜免疫能力的活性物质存在,如细菌细胞壁的多糖成分等。我们在前期初步试验中,在羔羊出生后24小时内,试验组每天用奶瓶补喂20ml健康育肥绵羊瘤胃液,其它按试验羊场常规方法管理。试验结果显示

16、,试验组羔羊15日龄、30日龄、35日龄时的平均增重(kg)分别为2.91、4.02、4.73,对照组相应日龄时平均增重(kg)分别为2.12、3.47、4.02,试验组比对照组分别提高了37.3%、15.9%、17.7%;在整个试验期的前15天内,试验组羔羊只发生间歇性的腹泻,对照组连续腹泻2天以上的占试验羊只数的21%,有的只能用抗生素子以治疗(详细数据见本申请书的“(二)研究基础”部分)。我们对补喂的瘤胃液中可能存在的作为小肠黏膜免疫应答刺激物的脂多糖(内毒素)含量进行了测定,用反相高效液相色谱法对分离的瘤胃细菌破碎物中组成肽聚糖的、可能具有免疫调节作用的成分进行了初步分离根据小肠黏膜免

17、疫应答形成的微生物刺激理论,动物出生后肠道内细菌的早期刺激有可能使动物肠道粘膜免疫、机体系统免疫形成的时间提前。因此,动物出生后尽早通过口服接种有益菌(如来自健康动物胃肠道中的微生物制剂)或其成分可调节肠道粘膜免疫,而上述相关试验中新生动物早期肠道接种细菌后所表现出的动物腹泻发生率明显下降、腹泻延续时间明显缩短、动物增重提高等的积极作用可能与肠道内细菌的早期刺激、促使小肠黏膜免疫应答的提前形成和建立有密切关系。13本项目的研究目的和意义由上述可见,羔羊、犊牛等从出生至断奶,是机体免疫力形成并抵抗各种肠道病原菌感染的关键时期,机体依靠三个途径抵抗各种肠道病原菌的侵袭:一是依靠初乳中的母源性抗体形成的被动免疫机制,二是依靠胃肠道中逐渐建立的微生物诱导产生的天然免疫机制,三是经天然免疫介导并以sIgA为特征的黏膜体液免疫应答机制。肠道内微生物的刺激是后两种机制形成并建立的最重要影响因素本项目基于肠道黏膜免疫应答形成的微生物刺激理论,结合前人相关研究结果及我们前期的初步试验结果,提出以下假设并进行相关研究:(1)早期补喂来自健康成年羊(牛)的瘤胃液或瘤胃活细菌可使新生羔羊小肠黏膜免疫应答形成的时间提前;(2)补喂灭活的瘤胃细菌或细菌破碎物仍具有前述补喂瘤胃活细菌的作用;(3)早期细菌接种的作用与内毒素、肽聚糖或其降解片段等有关第7页

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