1、第四章 基因重组育种,微生物中部分导致基因重组的形式,第四节 真菌的有性生殖,有性生殖的基因重组通过减数分裂过程中的染色体交换和随机分配而导致基因重组减数分裂过程中，染色体交换和减半是一个很有规律和协调的过程一、粗糙链孢菌的有性生殖二、酵母菌的基因重组,一、粗糙链孢菌（Neurospora crassa）,遗传学研究的模式菌子囊菌纲，单倍体生活史菌丝体：无隔多核菌丝无性生殖：分生孢子小分生孢子：单核大分生孢子：多核有性生殖：不同接合型的菌株间，异宗接合（一种接合型）原子囊果着生受精丝，（另一种接合型）分生孢子落在受精丝上导致受精，形成 2 n 体，2 n 核经减数分裂形成 4 个单倍体核，再经
2、一次有丝分裂形成 8 个单倍体核，进而形成 8 个子囊孢子,粗糙链孢菌的生活史,单倍体生活史,顺序四分体的遗传学分析,顺序四分体：粗糙脉孢菌有性生殖过程，以减数分裂形成的孢子不仅共处于一个子囊中，而且它们是依次直线排列在子囊中，邻接的每一对孢子具有相同的基因型。这样的以直线方式排列在同一个子囊内的四个减数分裂产物称为顺序四分体。粗糙脉孢菌基因分离和高等生物基因分离的区别脉孢菌的子囊孢子是单倍体，减数分裂的结果可以直接表现出来，不需经回交或再自交；减数分裂的产物包含在一个子囊中，所以很容易观察等位基因的分离；8个子囊孢子顺序排列在子囊中，使得基因与着丝粒之间的交换也得以表现出来,子囊类型 分离类
3、型 子囊数AAAAaaaa 105aaaaAAAA 129AAaaAAaa 9aaAAaaAA 5AAaaaaAA 10aaAAAAaa 16排列方式和减数分裂时的染色体行为特点有关,N.crassa接合型基因子囊类型（Lindegren，1932）,有性繁殖过程中着丝粒的分离情况,分裂类型,还原分裂：来自同一亲本的两个基因趋向同一极的分裂均等分裂：来自同一亲本的两个基因分别趋向两极的分裂,第一次分裂分离,第二次分裂分离,定义：某一基因与着丝粒之间的距离,着丝粒距离,二、酵母菌的基因重组（杂交育种）,酵母菌的杂交(有性杂交):通过有性生殖过程完成，利用两种不同的接合型的单倍体菌株或子囊孢子进行
4、的无有性生殖酵母:准性生殖过程进行杂交如假丝酵母酵母的生活史 无性生殖：出芽的方式 有性生殖：体细胞或子囊孢子进行接合、核配、减数分裂,真酵母属(Saccharomyces)单倍体世代和二倍体世代,酵母菌的杂交育种,开展早，较完善1938年，遗传学的基础理论、操作技术工业育种方面的成效面包酵母的种间杂交繁殖能力和发酵能力都强；面包酵母和酒精酵母杂交保持酒精发酵力，发酵麦芽糖的能力比亲株高，酒精发酵后，还可供面包厂发酵面包用；糖蜜酒精酵母R系（不能完全利用棉子糖）与卡尔斯伯酵母（全发酵棉子糖）杂交，杂交子提高了甜菜糖蜜的酒精产量和发酵速度；上面啤酒酵母与下面啤酒酵母杂交，生产出香与味较好的啤酒,
5、酵母菌的杂交育种程序,1、亲株的选择两个亲株具有亲和性：不同的接合型具有不同的标记，以作为杂种的检出依据。形态方面标记：细胞大小、形态、菌落特征、色素及凝聚性；生理方面标记：氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等营养缺陷型，耐性抗性（高浓度酒精、高浓度糖的耐性，抗生素的抗性），发酵特性（各种糖类）等,2、子囊孢子的形成饥饿条件易促进细胞发生减数分裂而形成子囊孢子生孢培养基：醋酸钠琼脂培养基、石膏块生孢需要的生理条件：1）缺乏 N 源；2）具有非发酵性 C 源（如醋酸盐等，提供能量和 C 源）；3）合适的温度（2535）及 pH（中性或近中性）。生孢需要的遗传条件：1）细胞必需是a/二倍体，即细胞必需同时
6、具有 MATa 和MAT等位基因2）生孢专一性基因 ssg 具有活性3）细胞具有呼吸能力,3、酵母子囊孢子的分离,无菌水洗下子囊，加入液体石蜡和硅藻土，研钵中研磨,转移到离心管中，以4500rpm离心10min,子囊孢子集中在上层石蜡层中。用蜗牛酶或Zymolyase-20T酶解子囊壁，激烈振荡，使子囊裂解，释放子囊孢子，所得悬液再添加液蜡，离心后孢子也集中在上层液蜡中取集中子囊孢子的液蜡50uL，加明胶，涂CM平板，获得单倍体菌落,4、杂交、获得杂交子,孢子杂交法：子囊孢子直接成对杂交 用显微操纵器将不同亲株的子囊孢子直接配对，进行微滴培养，使之发芽接合，形成合子 优点：在显微镜下直接观察到
7、合子的形成；缺点：需精密的仪器和娴熟的技术，费工也大单倍体细胞杂交法：接合型细胞直接配对杂交 两种接合型细胞配对放在微滴培养基中，在显微镜下观察合子的形成，成功率较低 群体杂交法：把不同接合型单倍体亲本的液体培养物（YEPD）等量混合，使其进行杂交常用镜检发现大量的哑铃型接合细胞时，就可以涂布进行杂交子的选择 根据亲株的不同标记，用选择性培养基检出杂交子,群体杂交,第五节 真菌的准性生殖,准性生殖：真菌中不通过减数分裂而导致基因重组的过程称为准性生殖。能进行准性生殖的微生物：Aspergillus nidulans;Asp.niger;Asp.sojaePenicillium chrysoge
8、num;Fusarium oxysporum准性生殖的过程（三个阶段）异核体(heterokaryon)形成；杂合二倍体形成；分离子的形成体细胞交换和单元化,真菌的有性和准性循环,一、真菌的准性生殖,异核体,异核体细胞：并存有两个不同遗传性状的核细胞异核体菌丝体：由异核体细胞构成的菌丝体异核体的无性繁殖：产生亲代类型的单倍体分生孢子两个不同营养缺陷型突变株所产生的分生孢子大量混合培养在基本培养基（含贫乏营养）表面，往往可以得到少数原养型菌落在它们的一条菌丝内具有两种基因型的细胞核-异核体。,（1）异核体的形成,(1)选择亲本 A 亲缘关系近 B 生活力、产生分生孢子的能力及数量相似 C带不同的
9、遗传标记(2)创造形成异核体的条件 A 限制性培养基 B 孢子混合数量：106108,异核体的证实,互养的排除：从原养型菌落尖端取少量菌丝，培养在营养贫乏的培养基上，把从接种处长出的菌丝尖端割下，接种基本培养基上，不生长说明为互养，生长说明是异核体。重组体排除：收集异核体产生的分生孢子100 100000 个，培养在纯净基本培养基上不生长。孢子颜色突变株：分生孢子颜色仍为白色或黄色，不形成分生绿色孢子,异核体的证实,异核体的意义与应用,异核体在自然界广泛存在意义：1）对有性生殖的补充；2）生长优势；3）保存隐性突变。应用：主要指遗传学研究中的应用1）用来测定等位基因或非等位基因突变；2）细胞质
10、遗传学研究的工具；3）可测定等位基因的显隐性关系,（2）（杂合）二倍体的形成,将 106107 个异核体的分生孢子涂至MM上，长出的少数菌落即为二倍体不同于前述菌落，它们的分生孢子都能在基本培养基上生长二倍体是少数异核体发生核融合形成的，某些理化因素可提高二倍体出现的频率，如樟脑蒸汽和 uv。,二倍体的验证,检出：避免异核体分生孢子重新形成异核体的措施MM要十分纯正（更纯净）采用具有分生孢子颜色突变型和营养缺陷型作亲本的遗传标记,例：Asp.nidulans 分生孢子颜色突变 w+y-:黄色 w-y+:白色 w+y+:绿色,二倍体孢子与单倍体孢子的区别,定义：二倍体在有丝分裂过程中发生基因重组
11、，使隐性基因得以表达，由此产生各种类型的分离子。分离子的形成1、体细胞交换2、单元化过程,（3）有丝分裂分离,A、体细胞交换,体细胞交换：在有丝分裂过程中，同源染色体间发生的交换，从而导致部分基因的纯合化。体细胞重组体：通过体细胞交换而形成的分离子。有丝分裂定位离着丝粒愈近的基因纯合化的机会愈小，愈远则愈大；着丝粒一端基因的纯合化不影响着丝粒另一端基因的纯合化。,体细胞交换,B、单元化过程,单元化过程：在有丝分裂过程中一再发生染色体不分开行为从而形成单倍体的过程。二倍体三体(2n+1)+单体(2n-1)非整倍体及单倍体分离子,单元化,体细胞交换与单元化的区别,分离子及其来源二倍体分离子：来源于
12、体细胞交换或单元化非整倍体分离子：来源于单元化单倍体分离子：来源于单元化(2)二倍体分离子与单倍体分离子判别Asp.nidulans二倍体分离子分生孢子体积大,体细胞交换与单元化的区别,(3)二倍体分离子与非整倍体分离子判别非整倍体分离子在无性繁殖子代中继续出现另一基因的分离(4)发生概率体细胞交换和单元化是两个独立发生的事件，二者发生在同一个细胞中的概率很小,准性生殖全过程示意图,有性生殖与准性生殖的区别,二、准性杂交育种,1、杂交亲株的选择亲株要求形态上必须稳定，能形成丰富的分生孢子具有较强的重组性能营养突变型作亲株，希望产量性能不低于原来的出发菌株杂种鉴定标记生理特征（营养缺陷型，抗药性
13、，产量）最好选用单核的分生孢子菌株变异在当代就可表现出来黑曲霉、青霉为单核分生孢子米曲霉、黄曲霉为多核分生孢子 杂交亲株往往是对野生型先进行诱变获得的,2、异核体的形成,亲株混合接触把两配对菌株高浓度的分生孢子悬液或菌丝涂布在固体 MM上，将数量相等的配对菌株孢子液混合接种到液体MM或CM中，使它们形成一层互相交织的菌丝网采用1mL生理盐水加到10mL的固体CM上，然后把配对分生孢子混合接种到1毫升的生理盐水中，让其在液面长出一层菌丝混合菌丝生长后，挑取菌丝进行异核体的分离借助生长前情况和分生孢子颜色，发现固体培养基上的异核体，切取菌丝尖端一小部分，一次移植到新鲜培养基上，就可形成一个纯的异核
14、体菌落自液体CM中取出生长菌丝，放在液体MM中浸洗后，移植到固体MM表面培养，切下菌丝尖端再移植至固体MM培养,形成异核体的方法,(a)混合培养法(b)有限培养基混合培养法(c)斜面衔接法(d)异核丛形成法,异核体具有这样一些特征：将异核体的单一菌丝尖端移植至MM或CM上，都能继续生长形成异核体把少量的异核体所产生的分生孢子培养到MM上，就不能生长（除非孢子中混有异核体菌丝片段），还是形成二亲株形态的菌株 把大量异核体产生的分生孢子在MM上分离培养，有时会长出少数杂合二倍体或个别重新形成二次异核体菌落。,3、杂种（杂合二倍体或重组体分离子）的获得,杂合二倍体：由两个不同的单倍体核融合而形成的杂
15、种细胞表示：W his-Y arg-获得：从异核体菌落的斑点或角变得到，或从异核丛分离得到，可能混有亲本的分生孢子或其他分离子要确定一株杂合二倍体必须经过一次以上的分离纯化，也可利用显微操纵器挑取一个孢子繁殖成一个菌落。与亲株比较，杂合二倍体的产量性状情况比较复杂特征：与异核体不同，与亲本也不同杂合二倍体孢子的体积比单倍体孢子二倍杂合二倍体分生孢子的DNA含量约为单倍体的二倍杂合二倍体的孢子颜色与异核体不同杂合二倍体相当稳定,人工方法促使杂合二倍体的产生,(1)樟脑蒸汽处理法：就是打开长有异核体的平皿盖，把平皿倒过来，复在盛有樟脑结晶的另一培养皿盖子上，放置几分钟，然后用原来盖子盖上，继续培养
16、。这时形成的杂合二倍体频率提高10-100倍。(2)紫外线处理法：就是用紫外线照射异核体的分生孢子数分钟，也可照射生长中的异核体菌丝来提高杂合二倍体形成频率。(3)高温处理法：有人用高温处理青霉菌异核体菌丝，也能提高产生杂合二倍体频率。,杂合二倍体分离后产生二倍体分离子自发产生以及用诱变因素处理来诱发产生分离子从杂合二倍体中检出分离子主要是通过对杂合二倍体菌落上产生的斑点或角变进行分离而获得目前霉菌的杂交主要是种内，偶尔有种间亲株的亲缘程度越远，则愈不易成功 在丝状真菌的杂交育种中成功的事例酱油曲霉通过体细胞重组及多倍体化，提高了蛋白酶活性及曲酸产量。四倍体的蛋白酶活性最高，为亲株的一倍；黑曲
17、霉的杂交育种，得到了多倍体新种，其柠檬酸产量比原始菌株高；用杂交育种得到了高产的灰黄霉素产生菌,第六节 原生质体育种,原生质体：微生物或植物去除细胞壁后的结构。原生质体的特性：基本保持原细胞结构、活性和功能，具有细胞的全能性。没有细胞壁；失去细胞刚性，呈球形；对渗透压敏感脆弱，不能分裂原生质体的再生使之恢复成正常的细胞并继续生长繁殖 原生质体融合育种原生质体转化育种原生质体诱变育种,单细胞和丝状菌原生质体的形成模式,一、原生质体融合育种,原生质体融合：通过人为方法，使遗传性状不同的两细胞的原生质体发生融合，并产生重组子的过程原生质体融合技术的实践意义可以采用产量较高的菌株作融合亲株；提高产量性
18、状的潜力较大，可实现多基因重组；有助于建立工业微生物的转化体系原生原体转化,原生质体融合育种的优势,重组频率高：霉菌和放线菌已达10-310-1，细菌与酵母已达10-610-5受接合型或致育性的限制较少：近亲，远亲均可进行；遗传物质的传递更完整：细胞质、整套染色体都参与可以多株同时参与融合；重组体种类多,原生质体融合技术的一般步骤,融合亲本的选择与标记；原生质体的制备；原生质体的融合；原生质体的再生；融合子的选择与鉴定；目标菌株的筛选。！原生质体育种的整个操作过程都必须保持高渗环境,1.亲本的选择与标记,亲本的选择：具有优良性状；具有一定遗传标记。亲本标记：营养缺陷型或抗药性等；自然标记；细胞
19、质遗传标记：小菌落、Killer等；生产性状本身。,2.原生质体制备,指以溶壁酶水解去除微生物细胞壁的过程培养至对数后期；预处理：细菌，亚抑制量青霉素；1-4%Gly；放线菌，1-4%Gly；酵母，1%巯基乙醇和1%EDTA；破壁：A、高渗溶液作渗透压稳定剂 B、破壁酶：细菌，放线菌：溶菌酶 霉菌：几丁质酶，纤维素酶 酵母：蜗牛酶或Zymolyase 浓度、温度、pH、时间，各不相同注意问题：渗透压稳定剂（高渗保护）；考虑再生，脱壁不能太完全。,3.原生质体融合,原生质体融合是指双亲原生质体混合在促融剂的作用下，细胞膜合二为一的过程。促融剂：能够诱导原生质体融合的物质称为促融剂，按其性质分为三
20、大类：生物促融剂：病毒类物质，最早发现和使用的促融剂；化学促融剂：PEG等，是使用最广泛的促融剂；物理促融剂（电诱导融合）：原生质体在电场中极化成偶极子，沿电力线方向排列成串；加直流脉冲，原生质体膜被击穿，导致融合,影响融合率的因素,原生质体制备与再生的条件；促融剂的种类和浓度；双亲组合及其原生质体的比例；其它,4.原生质体的再生,再生指原生质体重建细胞壁，恢复细胞完整形态并能生长、分裂的过程。再生培养基：加入渗透压稳定剂，不同微生物其再生培养基不同。再生需要一定的细胞壁做引物。影响再生的因素：再生培养基及培养条件；原生质体制备方法及条件菌种本身的再生特性,5.融合子的检出与鉴定采用选择性培养
21、基进行检出。对是否是真正融合子进行鉴定：发生核融合后稳定，而不进行核融合形成的异核体不稳定。6.目标重组子的筛选,原生质体融合技术的应用,（1）高产优良菌株的选育例：亲株：乳糖发酵短杆菌亲株1：产谷氨酸，DCr(德夸菌素)，KMr(酮基丙二酸)，发酵速度快；亲株2：产赖氨酸，AECr，发酵速度慢(100h)融合子：DCr KMr AECr，发酵速度快(30h)，产赖氨酸提高3倍（2）合成新的产物,其它原生质体技术,原生质体诱变育种：以脱去细胞壁的原生质体作为处理对象的诱变育种方法。优点：1）提高微生物对诱变剂的敏感性；2）提高正变株的变异幅度，使诱变效果提高；3）对于丝状微生物，原生质体可作为单个细胞 单位而便于控制，避免后代过多的分离现象。缺点：1）诱变后原生质体再生较慢，因此较常规诱变 育种耗时长；2）不适用于以青霉素淘汰野生型对营养缺陷型 突变体进行浓缩。,其它原生质体技术,原生质体再生育种：通过菌体细胞脱壁后直接再生来改变菌株的遗传特性，提高产量或改良某些性状的育种方法。特点：正变率较高。原生质体转化：以原生质体作为受体菌转化DNA分子的过程。优点：1）感受态容易建立，维持时间长；2）对转化DNA要求较低。原生质体的固定化,
