1、 Marine Sciences/Vol.46,No.12/2022 31 大钦岛不同养殖年限深水网箱沉积物微生物群落结构分析 解维俊1,2,赵玉庭2,刘元进2,胡顺鑫2,姜海滨2,韩慧宗2,王腾腾2,王 斐2,李兆龙1,2,张明亮2(1.上海海洋大学 水产与生命学院,上海 201306;2.山东省海洋资源与环境研究院,山东 烟台 264006)摘要:为研究深水网箱养殖年限对沉积物微生物群落结构的影响,分别对大钦岛海域养殖 3、8、13、18 a 网箱以及非养殖区(DZ)表层沉积物(02 cm)进行 16S rDNA 高通量测序。结果显示,长年网箱养殖(13、18 a)区域沉积物菌群的丰富度和
2、多样性均显著高于短期网箱养殖(3、8a)区域(P0.05)。随着养殖年限的增加,网箱沉积物优势菌门变化显著(P0.7 的注释结果,采用 QIIME14软件对 OTU 进行 多样性指数分析。多样性和差异 OTUs 分析使用 R 语言(www.r-project.org)统计软件进行分析。用 WPS Excle 2019 处理数据,Surfer 绘制采样点分布地图,并用 SPSS 24.0 软件进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)和相关性分析,P0.05),说明深水网箱长年养殖并未对底栖环境造成深远影响(表 2)。但养殖 18 a 区域硫化物含量最高,且显著高于对照区域(P0.05),
3、表明该区域 Cr 本底值较高,深水网箱养殖并没有明显增加其含量。表 2 养殖网箱沉积物理化因子测定结果 Tab.2 Results of the determination of physicochemical factors in sediment from aquaculture nets 区域划分 环境因子 3 a 8 a 13 a 18 a DZ 硫化物(106)43.68.9ab 43.22.8ab 30.50.6a 61.67.4b 31.21.7a 有机碳(%)0.3130.054 0.3170.013 0.3390.001 0.3110.057 0.2820.026 Cu(10
4、6)11.491.32 12.652.76 14.692.79 15.072.34 12.60.86 Zn(106)41.13.5 46.94.7 52.610.5 57.23.2 45.62.7 Cr(106)53.80.7 69.47.3 56.07.9 76.58.4 62.85.4 Hg(106)0.011 70.000 7 0.013 30.000 10.014 30.000 30.011 70.000 8 0.011 10.000 3Cd(106)0.1010.004 0.1350.038 0.1600.036 0.1690.026 0.0990.012 Pb(106)16.72.
5、0 18.22.8 22.64.1 22.53.5 19.03.1 As(106)12.11.4 13.50.7 14.42.1 14.52.4 16.00.3 石油类(106)23.71.4 23.74.8 29.01.9 25.80.8 20.32.8 注:表中同列数据后不同小写字母表示处理间差异显著(P0.05)2.2 高通量测序结果高通量测序结果 不同养殖年限网箱沉积物样品经高通量测序得到 clean tags(拼接后的 tags 数目)68 52573 761 条,有效序列 52 27467 696 条,聚类于 1 6625 207 个OTUs。样品测序覆盖率为 96.52%99.0
6、4%,说明测序可以很好地覆盖物种信息,抽样充分。养殖 3、8、13、18 a 以及非养殖区(DZ)中分别测到的 OTU 个数为5 954、6 079、7 385、7 659 和 6 119 个。不同养殖年限网箱沉积物共有的 OTU 数目为 1 807 个,约占各采样点总 OTU 数目的 25%。5 个采样区域特有的 OTU数目分别为:904 个(占 3 a 总 OTU 个数的 15.2%)、1 317个(占8 a总OTU个数的21.7%)、1 325个(占18 a总 OTU 个数的 17.9%)、1 512(占 18 a 总 OTU 个数的19.7%)、1 299 个(占非养殖区总 OTU 个
7、数的 21.2%)。该数据表明,各养殖年限网箱沉积物特有的微生物种类较多,微生物的组成存在差异性,总体来说长年养殖对网箱沉积物细菌群落结构具有明显影响,提高了沉积物微生物菌群的丰富度。图 2 不同养殖年限网箱沉积物中的微生物群落韦恩图 Fig.2 Venn diagram of microbial communities in net tank sediments of different culture years 34 海洋科学/2022 年/第 46 卷/第 12 期 2.3 网箱养殖年限对沉积物微生物网箱养殖年限对沉积物微生物 多样性的影响多样性的影响 采用 Chao1、物种丰富度 R
8、ichness、Shannon、Simpson 等指数对沉积物样本 多样性进行评估,结果(表 3)显示。不同养殖年限网箱沉积物菌群丰富度和多样性都具有显著性差异(P0.05),随养殖年限的增加,养殖网箱沉积物菌群的丰富度和多样性均呈上升趋势,且长年养殖网箱(13、18 a)沉积物菌群丰富度和多样性显著大于其他区域(P0.05),说明养殖年限可能是影响网箱沉积物细菌群落丰富度和多样性的重要因素之一。2.4 网箱养殖年限对沉积物微生物群落的影响网箱养殖年限对沉积物微生物群落的影响 5 个区域沉积物细菌在门水平上丰度排名前 10的门类分别为拟杆菌门(Bacteroidota),变形菌门(Proteo
9、bacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、脱硫菌门(Desulfobacterota)、弯曲杆菌门(Campilobacterota)、酸杆菌门(Acidobacteriota)、黏球菌门(Myxococcota)、放线菌门(Actinobacteriota)、NB1-j 和芽孢杆菌门(Gemmatimonadota)(图 3)。不同养殖年限网箱沉积物菌群组成在门水平上具有显著差异,养殖 3、8 a 以及非养殖区(DZ)的主要优势菌门为拟杆菌门,变形菌门 表 3 各位点沉积物 多样性分析 Tab.3 Analysis of sediment alpha diversity at e
10、ach site 区域划分 Chao1 物种丰富度 Shannon Simpson coverage 3 a 3 622.99b 2 619.73 8.19b 0.973 209 0.982 4 8 a 4 122.69b 3 014.13 8.26b 0.977 457 0.979 2 13 a 5 381.66a 4 033.03 9.27a 0.986 549 0.972 7 18 a 6 284.32a 4 716.80 9.41a 0.985 322 0.973 4 DZ 4 290.68b 3 102.93 8.55b 0.978 264 0.979 0 注:表中同列数据后不同小写
11、字母表示处理间差异显著(P61.77%),养殖 13、18 a 的主要优势菌门为拟杆菌门,变形菌门和脱硫菌门(总相对丰度61.98%)。养殖 3、8 a 网箱沉积物厚壁菌门相对丰度分别为 28.16%、32.70%,养殖 13、18 a 网箱沉积物厚壁菌门相对丰度分别为 5.60%、7.26%,长年养殖显著降低了厚壁菌门的相对丰度(P0.05)。养殖3、8 a 网箱沉积物脱硫菌门相对丰度分别为 9.90%、12.23%,养殖 13、18 a 网箱沉积物脱硫菌门相对丰度分别为 25.53%、16.80%,长年养殖显著提升了脱硫菌门的相对丰度(P0.05)。非养殖区沉积物检测出的拟杆菌门相对丰度(
12、37.60%)高于所有养殖区沉积物拟杆菌门相对丰度(20.50%),并且显著高于其在养殖 8、13 a 沉积物中的相对丰度(P0.05),其他菌门相对丰度较小,不同区域差异也不显著(P0.05)。菌属水平下,不同养殖年限网箱沉积物优势菌属(相对丰度2%)呈现出显著性差异(P0.05)(图 4)。养殖 3 a 网箱沉积物优势菌主要隶属于硫卵菌属(Sul-furovum)(10.45%)、嗜中温温暖杆菌(Tepidibacter)(5.54%)、拟杆菌属(Bacteroides)(5.40%)、毛囊菌属(Muribaculaceae)(3.84%)和 Sva1033(2.52%)。养殖 8 a网箱
13、沉积物优势菌主要隶属于硫卵菌属(10.71%)、Sva1033(5.40%)、毛囊菌属(4.40%)和毛螺菌科(Lach-nospiraceae)_NK4A136_group(2.74%)。养殖 13 a 网箱沉积物优势菌主要隶属于 Sva1033(9.16%)、硫卵菌 属(7.63%)、B2M28(2.97%)、Sva0081_sediment_ group(2.74%)、Subgroup_23(2.29%)、海球菌属(Halio-globus)(2.26%)和伍斯菌属(Woeseia)(2.08%)。养殖 18 a网箱沉积物优势菌主要隶属于硫卵菌属(11.54%)、Sva1033(5.49
14、%)、毛囊菌属(2.90%)、B2M28(2.40%)、伍斯菌属(2.27%)和拟杆菌属(2.20%)。非养殖区(DZ)沉积物优势菌主要隶属于拟杆菌属(16.13%)、毛囊菌属(11.81%)、另枝菌属(Alistipes)(3.68%)、毛螺菌科_ NK4A136_group(3.49%)和硫卵菌属(2.93%)。5 个区域沉积物优势菌属均包含硫卵菌属,且其在 4 个养殖网箱区域沉积物的相对丰度均显著大于非养殖区(DZ)(P0.05)。Sva1033 仅是 4 个养殖网箱区域沉积物的优势菌属,且其在养殖 8、13、18 a 网箱沉积物的相对丰度均显著大于非养殖区(DZ)(1.66%)(P0.
15、05)。拟杆菌属、毛囊菌属是非养殖区沉积物的优势菌属且相对丰度较高,显著高于其在养殖区域沉积物的相对丰度(P0.05)。图 4 沉积物微生物群落组成(属水平)Fig.4 Sediment microbial community composition(genus level)36 海洋科学/2022 年/第 46 卷/第 12 期 选取样品相对丰度前 30 的菌属进行聚类分析,并绘制 Heatmap 图(图 5)。在属分类水平上可以看出,硫卵菌属随养殖年限的增加呈现先降低后上升的趋势,与硫化物含量变化趋势一致。随养殖年限的增加,优势菌属的数量也增加。由聚类结果可知,养殖 3、8 a 可以聚为一
16、支,养殖 13、18 a 可以聚为一支,随后 4 个养殖区聚为一支,非养殖区单独为一支。同时,采用主成分分析(PCA)对不同养殖年限网箱沉积物菌落结构差异进行分析(图 6),分析结果与聚类分析结果较为相似,养殖 3、8 a 与非养殖区(DZ)在第一主成分上和养殖 13、18 a 被明显地区分,说明网箱养殖年限明显影响沉积物细菌群落结构。部分区域的 3 个重复样品的聚集性较差,组内细菌群落组成存在差异,原因是同一养殖年限网箱区域面积过大,取样时为了更好地展示其真实菌落结构情况,取样位置跨度较大所致。图 5 沉积物微生物属水平热图 Fig.5 Horizontal heat map of sediment microbial genera 2.5 养殖网箱沉积物微生物群落与环境因子相关性养殖网箱沉积物微生物群落与环境因子相关性 将养殖网箱沉积物样品中细菌丰度前 15 属与沉积物理化因子进行微生物环境因子分析(图 7),采用协方差矩阵进行计算。其中,Sva1033 与 Hg 含量呈显著正相关(P=0.034,r=0.670)。Sva0485 与 Cd 含量呈显著正相关(P=0.049,r=0
