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苁蓉舒痉颗粒对帕金森病模型...γ_PGC-1α通路的影响_袁欣欣.pdf

上传人:哎呦****中 文档编号:348010 上传时间:2023-03-22 格式:PDF 页数:4 大小:2.05MB
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资源描述

1、收稿日期:;修订日期:基金项目:国家自然科学基金(;);国家“重大新药创制科技”重大专项();福建省中医药科研项目计划()资助作者简介:袁欣欣(),女(汉族),安徽安庆人,福建中医药大学在读硕士研究生,主要从事中西医结合老年病方向研究工作通讯作者简介:蔡 晶(),女(汉族),福建福州人,福建中医药大学附属第三人民医院教授,博士学位,主要从事中西医结合老年病方向研究工作苁蓉舒痉颗粒对帕金森病模型小鼠额叶 通路的影响袁欣欣,张楚天,黄佩珍,黄妙安,李茜羽,陈诗雅,蔡 晶(福建中医药大学中西医结合研究院,福建 福州;福建中医药大学附属第三人民医院,福建 福州)摘要:目的 探究苁蓉舒痉颗粒对 模型小鼠

2、额叶保护作用及其机制。方法 腹腔注射 复制 模型。实验分组为正常组、模型组、苁蓉组和美多芭组。在造模第 天、给药 天后,对小鼠进行行为学测试;免疫组化检测小鼠黑质 阳性细胞的表达;透射电镜观察小鼠额叶线粒体损伤情况;检测小鼠额叶中 和 含量的表达;检测小鼠额叶中、蛋白的表达。结果()行为学:造模 后,与正常组比较,模型组悬挂、爬杆评分、抓力值、自主活动次数降低,给药治疗 后,与模型组比较,苁蓉组、美多芭组悬挂、爬杆得分、自主活动次数增加。()免疫组化:与正常组比较,模型组小鼠黑质 阳性细胞数明显减少;与模型组比较,苁蓉组、美多芭组小鼠黑质 阳性细胞数明显增多。()透射电镜:与正常组比较,模型组

3、额叶线粒体出现肿胀、空泡样,嵴断裂甚至消失;与模型组比较,苁中组与美多芭组额叶线粒体数量有所增加,形态有所改善。():与正常组比较,模型组小鼠、表达水平明显降低;与模型组比较,苁蓉组、美多芭组小鼠、表达水平明显升高。():与正常组比较,模型组、蛋白表达量明显降低;与模型组比较,苁蓉组、美多芭组蛋白表达量明显升高。结论 苁蓉舒痉颗粒可以减少 模型小鼠额叶损伤,这种保护作用可能是通过调节 通路实现。关键词:苁蓉舒痉颗粒;帕金森病;额叶;通路;认知障碍 标识:中图分类号:文献标识码:文章编号:(),(,;,):,(),(),(),()():,();,()():,;,时珍国医国药 年第 卷第 期,()

4、:,();,()():,();,、(),:;帕金森病(,)是世界第二大神经系统退行性疾病,其影响超过 的 岁以上人口,发病率随着年龄的增长而迅速上升,加重了社会医疗负担。的发病机制与内质网应激、线粒体功能障碍、失衡、蛋白质异常聚集、激酶信号通路等均有密切关系。其中线粒体功能障碍是关键病理因素,过氧化物酶体增殖物激活受体 (,)辅 助 激 活 因 子 (,)通路与线粒体功能关系密切。是一种调节细胞功能的受体,参与各种细胞分化、细胞生长、脂质代谢和炎症;是线粒体生物发生和氧化应激的关键调节剂。可以诱导 以及线粒体转录因子()的表达来调节线粒体的合成,在炎症反应、氧化应激、细胞凋亡、线粒体功能改变中

5、发挥重要作用。研究发现,帕金森病不仅会造成运动障碍,还会累及整个大脑神经系统,在疾病后期导致认知功能障碍,严重影响帕金森病患者的生存质量。额叶是大脑发育最高级部分,与认知功能关系密切,病程进展到第五期,损伤会累及额叶,导致额叶和颞叶代谢变化降低,从而损伤认知功能。研究发现,的 患者符合轻度认知障碍标准,高达 的 患者在发病 年后发展为痴呆。而 引起认知功能障碍可能源于额叶皮质结构连通性的改变。目前关于帕金森病是如何损害额叶导致认知障碍的研究较少。课题组前期研究已证明苁蓉舒痉颗粒可以通过降低多巴胺能神经元的凋亡来缓解帕金森病,但未研究苁蓉舒痉颗粒如何通过减少额叶损伤来缓解 患者的认知障碍。故本实

6、验通过观察 模型小鼠行为学变化、额叶线粒体形态变化及 通路相关蛋白及其 表达水平,探讨苁蓉舒痉颗粒减少额叶损伤缓解 患者认知障碍的作用机制。材料与仪器 实实验验动动物物 周龄健康雄性 小鼠 只,体重(),购自杭州医学院,饲养于福建中医药大学实验动物中心,温度控制在(),相对湿度 ,光照 黑暗周期为,摄食饮水自由实验动物生产许可证:(浙);实验动物使用许可证:(闽)。实实验验药药物物 苁蓉舒痉颗粒中药复方制剂由肉苁蓉,制黄精,丹参,赤芍,牡丹皮 组成,按照一定的比例浓缩制备成浸膏粉,多巴丝肼片(购于福建中医药大学附属第三人民医院)。试试剂剂和和仪仪器器(源叶生物,批号:);裂解液(源叶生物,批号

7、:)、蛋白浓度测定试剂盒(源叶生物,批号:)、过氧化物酶显色试剂盒(博士德生物,批号:)、抗体(武汉三鹰,批号:)、抗体(武汉三鹰,)、抗体(武汉三鹰,批号:)、抗体(武汉三鹰,批号:)、抗体(武汉三鹰,批号:)、抗体(武汉三鹰,批号:);引物 (尚亚生物,批号:)、引物 (尚亚生物,批号:)、引物 (尚亚生物,批号:);即用型免疫组化超敏检测试剂盒(博士德生物,批号:)。电泳仪器、转膜仪器、凝胶成像仪器(美国 公司);荧光定量 仪(赛默飞);石蜡包埋机(艾普迪实验器材制造有限公司);大小鼠抓力测定仪(北京众实迪创);透射电子显微镜(艾普迪实验器材有限公司)。方法 造造模模及及分分组组 随机选

8、取 只小鼠作为正常组(不予处理)。将实验小鼠连续 天腹腔注射 溶液()制备小鼠模型。根据模型评分标准(如表 所示),将造模成功(分)的 小鼠均分为模型组、苁蓉组、美多芭组,每组 只。根据实验动物与人的等效剂量比值(),计算出小鼠的苁蓉舒痉颗粒给药剂量()、美多芭给药剂量(),正常组和模型组予生理盐水灌胃,持续。表 帕金森病模型小鼠评分标准评分评分标准 分与正常小鼠相似,无任何症状 分出现竖毛、弓背、间断性细小震颤,但活动自如 分出现吞咽频繁,频繁性震颤,后肢张开,颤尾、竖尾,活动逐渐受限 分出现流涎、持续性震颤、四肢僵硬,活动受限 分因全身麻痹而死亡 行行为为学学检检测测 每日观察小鼠的一般情

9、况。在造模第 和治疗第 分别对各组小鼠在同 进行悬挂实验、爬杆实验、抓力实验、自主计数实验,具体操作如下。悬悬挂挂实实验验 选取直径 铁丝,距地面,将小鼠后肢横挂在线上,观察小鼠后肢抓住铁丝情况。评分标准如表 所示。表 悬挂实验评分标准评分评分标准 分连续三次摔倒 分两个后肢都抓不住线 分一只后肢抓不住线 分双后肢抓住线 爬爬杆杆实实验验 选取直径,长 的木杆,顶端装一直径 小球,缠上纱布,将小鼠放置小球上,头朝下,观察小鼠爬行情况。评分标准如表 所示。表 爬杆实验评分标准评分评分标准 分四肢并用,一次顺利从杆上爬下 分一步一步螺旋向下爬兼有后肢滑行行为 分上杆后间歇停顿数次后爬下,但可抱紧金

10、属杆 分滑行后掉落 分不能抓杆,直接掉落 抓抓力力实实验验 使用抓力仪器,将小鼠前肢握住抓力仪器,轻轻平行向后拉小鼠尾巴,记下最大拉力值。自自主主计计数数 在治疗的第,使用自主计数仪,将小鼠放置计数仪中,设置,记下小鼠活动次数。取取材材 各组小鼠使用 乌拉坦()腹腔注射,每组选 只灌注,只取额叶 多聚甲醛固定,用于免疫组化 只时珍国医国药 年第 卷第 期 取额叶 戊二醛固定,用于透射电镜;其余 只正常断头取脑,取额叶,用于 。免免疫疫组组化化 组织于多聚甲醛中固定 后,石蜡包埋切片。切片烘干后脱蜡,进行抗原修复,而后内源性过氧化物酶孵育,清洗后非特异性染色阻断剂孵育,孵育一抗 过夜、次日 烘箱

11、复温,孵育二抗,清洗后链霉菌抗生物素蛋白 过氧化物酶孵育。最后进行 显色。透透射射电电镜镜 各组小鼠额叶部位取大小为 的脑组织块,的戊二醛固定,并用 醋酸双氧铀染色,制成厚度为 ()的超薄切片,透射电子显微镜观察线粒体的形态。称取 额叶组织放入 ,充分裂解静置,加入 氯仿,剧烈震荡,静置 后,离心,抽取无色溶液,加入等体积异丙醇,混匀静置,再次离心,弃上清加 乙醇,混匀静置再离心,干燥后加入适量 溶解,测出 浓度。进行逆转录(),逆转录完毕进行 实验。见表。表 引物序列基因引物序列():检检测测 称取 额叶组织放进 管中,加入 裂解液,进行研磨,静置 后,离心 ,吸取上清液,部分用作 实验测定

12、上样量,其余加 上样缓冲液后变性。而后配胶、上样、电泳、转膜、封闭,配置、抗体(:),将膜浸入,孵育过夜。次日配置相应二抗(:),孵育。加显色剂(:配置)后显影,用 图像分析软件进行分析。统统计计方方法法 实验数据采用 软件分析。计量资料用?表示,实验数据各组间比较采用单因素方差分析。组间两两比较,方差齐则采用 法;方差不齐则采用 法。检验水平 。结果 模模型型鉴鉴定定结结果果 行行为为学学鉴鉴定定 造模 后,小鼠毛色暗淡,活动明显受限,前肢持续震颤,后肢僵硬行动异常,出现竖尾颤尾。行为学鉴定显示,与正常组相比,模型组、苁蓉组、美多芭组悬挂实验评分显著降低(),爬杆实验评分显著增加(),小鼠抓

13、力明显下降()(见表)。表 造模后小鼠行为学结果(?)组别悬挂实验 分爬杆实验 分抓力实验 正常组 模型组 苁蓉组 美多芭 与正常组比较,;小小鼠鼠黑黑质质 阳阳性性细细胞胞的的表表达达情情况况 免疫组化结果显示:与正常组比较,模型组小鼠黑质 阳性细胞数明显减少();与模型组比较,苁蓉组、美多芭组小鼠黑质 阳性细胞数明显增多()(见表、图)。表 小鼠黑质 阳性细胞的表达情况(?)组别 阳性细胞数 个正常组 模型组 苁蓉组 美多芭 与正常组比较:,;与模型组比较:,;图 各组小鼠黑质 阳性细胞的表达情况()行行为为学学检检测测结结果果 苁蓉舒痉颗粒和美多芭治疗后,与模型组比较,苁蓉组、美多芭组悬

14、挂评分增加()、爬杆得分增加()、自主活动次数增加(),抓力没有明显差异()(见表)。表 苁蓉舒痉颗粒干预后小鼠行为学结果(?)组别悬挂实验 分爬杆实验 分抓力实验 自主活动 次正常组 模型组 苁蓉组 美多芭 与正常组比较:,;与模型组比较:,;透透射射电电镜镜观观察察小小鼠鼠额额叶叶线线粒粒体体损损伤伤情情况况 正常组线粒体呈椭圆状,线粒体嵴完整;与正常组相比较,模型组线粒体出现肿胀、空泡样,有少量嵴,嵴断裂甚至消失;与模型组比较,苁中组与美多芭组线粒体数量有所增加,形态有所改善,线粒体嵴有所恢复(见图)。图 透射电镜下各组小鼠额叶线粒体损伤情况()小小鼠鼠额额叶叶 、的的表表达达情情况况

15、与正常组比较,模型组小鼠、表达水平明显降低();与模型组比较,苁蓉组、美多芭组小鼠、表达水平明显升高(,)(见表)。表 小鼠额叶、表达情况(?)组别 表达量 表达量正常组 模型组 苁蓉组 美多芭 与正常组比较:,;与模型组比较:,;时珍国医国药 年第 卷第 期 小小鼠鼠额额叶叶 、蛋蛋白白表表达达检检测测与正常组比较,模型组、蛋白表达量明显降低();与模型组比较,苁蓉组、美多芭组蛋白表达量明显升高(,)(见表、图)。表 小鼠额叶、蛋白表达情况(?)组别 正常组 模型组 苁蓉组 美多芭 与正常组比较:,;与模型组比较:,;图 各组小鼠额叶 通路相关蛋白表达情况 讨论苁蓉舒痉颗粒为课题组于“重大新

16、药创制”科技重大专项中研发的抗帕金森病肌强直中药(),目前已获得国家专利(专利号:)。课题组前期研究已从多个方面证明苁蓉舒痉颗粒可以有效改善 症状。为了证实苁蓉舒痉颗粒对神经细胞的保护作用,本研究对小鼠黑质 阳性细胞数进行了检测,免疫组化结果显示,模型组小鼠相较于正常组小鼠 阳性细胞数明显减少(),证明此次造模成功;苁蓉组小鼠相较于模型组 阳性细胞数明显增多(),明确了苁蓉舒痉颗粒对神经细胞的保护作用。行为学测试结果显示,苁蓉组小鼠悬挂、爬杆评分、自主活动次数均优于模型组(或 ),说明苁蓉舒痉颗粒能有效缓解 导致的运动障碍。大脑额叶包括前区、中区和后区,是人体最重要的神经组织区域。前额叶皮层大致可分为外侧额叶区、眶额叶区、内侧额叶区和额极区,每个区域的损伤都会导致不同的认知和行为症状。前额叶皮层,在控制行为、保持工作记忆、组织目标导向行为、计划和心智理论方面起着关键作用。当额叶病变发生时,患者会有智力低下、注意力不集中、执行功能低下等表现,这被称为额叶性精神障碍。其中核心执行功能包括工作记忆、认知灵活性和反应抑制,执行功能损伤也是 最突出的认知损害。许多疾病与额叶功能障碍有关,包括帕金

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