1、第四节 酶的活力测定及分离提取,一、酶活力的测定（一）活力（性）的表示方法（二）测定二、酶的分离提取,一、酶活力的测定,（一）活力（性）的表示方法、活力 v 测定酶活力就是测定酶促反应速度。v：单位时间内产物的生成量。单位时间内底物的消耗量。,2、酶的活力单位（U）：一定条件下，单位时间内催化一定量的底物起反应所需的酶量。1 个酶活力单位（U），是指在特定条件下，在1 分钟内能转化1 微摩尔（mol）底物的酶量或是转化底物中1mol 的有关基团的酶量。,1972 年国际生化协会酶学委员会推荐了一个新单位：Kat1 秒钟内转化1mol 底物的酶量。1Kat=6107U为了方便起见，有时用习惯法表
2、示，如GPT 的King 氏单位。即100ml血清与足量的丙氨酸、a酮戊二酸在37保温1h，每生成1umol丙酮酸为1个单位。淀粉酶可用每小时催化1 克可溶性淀粉液化所需要的酶量来表示。,3、酶的比活力 单位质量样品中的酶活力。如：1mg 蛋白质中所含的U 数。1Kg 蛋白质中所含的Kat 数。,比活力,活力单位数(IU),蛋白质（mg）,比活力,活力单位数(IU),酶制剂（g）,可表示酶制剂的纯度。在酶的提纯过程中，随着酶逐步被纯化，其比活力也在逐步增加，比活力越高，表明E 愈纯，在酶的提纯过程中，E 的总活力数会减少，但比活力却渐渐增加。,4、酶的转换数 Kcat 每秒钟每个酶分子转换底物
3、的微摩尔数。也即酶将底物转化为产物的效率。,（二）测定,要求：测定初速度最适条件SE活力测定常用方法：化学滴定法、比色法、比旋光度法、气体测压、测紫外吸收、同位素技术。,二、酶的分离提取,选材细胞破碎提取纯化浓缩注意：防止蛋白质变性。,第五节 影响酶促反应速度的因素,一、酶促反应速度的测量二、酶浓度对的影响三、底物浓度的影响四、pH 对的影响五、温度对的影响六、激活剂对的影响七、抑制剂对的影响,一、酶促反应速度的测量,酶促反应速度可表示为：单位时间内底物的消耗量 单位时间内产物的生成量,t,P,0,斜率=,dP,dt,酶反应动力学主要研究酶催化的反应速度以及影响反应速度的各种因素。在探讨各种因
4、素对酶促反应速度的影响时，通常测定其初始速度来代表酶促反应速度，即底物转化量5%时的反应速度。,二、酶浓度对的影响,反应条件固定且SE下,E,V,0,=K E,三、底物浓度对的影响,（一）S对的影响（二）米氏方程（三）Km,（一）S对的影响,pH、T、E固定,?,（二）米氏方程,Michaelis 和Menten 根据中间产物学说推导了能够表示整个反应中底物浓度和反应速度关系的公式，称为米氏方程式。1、基础中间产物学说,（1）S 与E 形成中间产物，且整个反应速度取决于ESP+E，即：V=K2ES（2）产物浓度P0（初速度）S E 反应达到动态平衡（ES 的生成=ES 的消失）,2、前提,K-
5、2忽略不计,3、推导,（1）S很小时SKm则V=Vmax零级反应（3）S处于Km附近时，混级反应,4、可用于判断反应级数,（三）米氏常数 Km,1、意义,Km=S,Km 的物理意义：当酶促反应速度为最大速度一 半时的底物浓度。,几种酶的Km值,大多数酶的Km介于10-610-1 mol L-1,Km 为E 的特征常数，在一定条件下为固定值。Km 与酶浓度无关，但与T、pH 有关Km 可近似表示酶与底物的亲和力，Km 值越大，亲和力越小。Km可用来判断酶的最适底物。,其他意义,2、Km的求法双倒数作图法,与直线方程y=ax+b相当,双倒数作图法,四、pH 对的影响,每一种酶只能在一定pH 下才能
6、表现酶反应的最大速度，高于或低于此值，反应速度都会下降，通常称此pH 值为酶反应的最适pH 值。,（1）一般酶最适pH48（2）植物56.5 动物6.58（3）最适pH 与等电点不一定一致。如胃蛋白酶最适pHpI（4）酶的最适pH不是酶的特征性常数。,（1）pH 影响E 结构的稳定性，过酸、过碱会强烈影响酶蛋白的构象，甚至使E 变性失活。（2）pH 影响E 分子上某些基团的解离状态。（影响结合基团、催化基团的解离 酶活力降低影响活性中心构象 影响酶专一性）（3）pH 影响S 分子某些基团的解离状态。,酶有最适pH 的原因,五、温度对反应速度的影响,一般来说，酶促反应速度随温度的增高而加快。但当
7、温度增加达到某一点后，由于酶蛋白的热变性作用，反应速度迅速下降，直到完全失活。酶促反应速度随温度升高而达到一最大值时的温度就称为酶的最适温度(optimum temperature)。,温度对的影响,V,最适T,T 升高，活化分子数增多,加快T 升高，酶蛋白变性,降低,Q10 温度系数：T 每增加10，增加的倍数。,注 意,（1）动物体内最适T 一般3050，植物4060，有少数酶能耐较高的温度，如某些细菌中分离的DNA 聚合酶，最适温度可达70，细菌淀粉酶在93下活力最大。（2）最适T，不是酶的特征常数，它与酶作用时间的长短、底物种类以及pH有关。（3）低温时由于活化分子数目减少，反应速度降
8、低，但温度升高后，酶活性又可恢复。,六、激活剂对的影响,能够促使酶促反应速度加快的物质称为酶的激活剂。1、无机离子 阴离子 Cl、Br；阳离子 H+金属离子（Zn2+、Cu2+、K+等）。2、中等大小的有机分子：GSH、Cys、VC、巯基乙醇、EDTA（乙二胺四乙酸）等。3、蛋白质物质。,七、抑制剂对的影响,（一）抑制作用的概念（二）不可逆抑制剂（三）可逆抑制剂,（一）抑制作用的概念,1、失活作用：凡使酶蛋白变性而引起酶活力丧失的作用。2、抑制作用：使酶活力下降，但并不引起酶蛋白变性的作用。（此作用使一部分酶的必需基团或辅助因子失活（活力变小）。,3、抑制类型,（1）不可逆抑制：I 与E 共价
9、结合，是一不可逆反应，二者结合后，不能透析除去抑制剂而恢复酶活力，称为不可逆抑制作用。（2）可逆抑制：I 与E 非共价结合，为可逆反应，透析能除去抑制剂使酶恢复活力，称为可逆a抑制作用。,无 I,可逆 I,不可逆 I,可逆与不可逆抑制剂的区别（一）,E,可逆与不可逆抑制剂的区别（二）,E,I,可逆 I,不可逆 I,（二）不可逆抑制剂,I 与E 共价结合，是不可逆反应，不能透析除去。常见不可逆抑制剂：烷化剂、酰化剂、氧化剂、有机磷、有机贡、氰化物、氮化物、重金属。,1、羟基酶抑制剂,2、巯基酶抑制剂,3）重金属盐类,金属离子 Cu2+Hg2+Pb2+Ag+Fe 3+等在高浓度时与酶蛋白结合成不溶
10、性盐而变性失活在低浓度时产生抑制作用,4）氰化物、硫化物和 CO,与酶中的金属离子形成较为稳定的络合物，使酶的活性受到抑制与细胞色素氧化酶的铁卟啉结合，抑制呼吸作用,5）青霉素,抗菌青霉素与糖转肽酶SerOH结合，使酶失活该酶催化细菌细胞壁中肽聚糖链的聚合，酶失活，细胞壁合成受阻，细菌生长受阻，青霉素起抗菌作用,（三）可逆抑制剂,I 与E 非共价结合，可透析除去。竞争性抑制剂I 与S 结构相似竞争与E 的结合部位结合。非竞争性抑制剂I 与S 结合在酶的不同部位。反竞争性抑制剂E 必须先与S 结合，然后才与I 结合,竞争性抑制（competitive inhibition）抑制剂与底物竞争与酶的同一活性中心结合，从而干扰了酶与底物的结合，使酶的催化活性降低，称为竞争性抑制作用。,酶的竞争性抑制反应模式,竞争性抑制的速度方程与图形特征,竞争性抑制的双倒数方程,
