1、蛋白质的结构与功能,第 三 章,Structure and Function of Protein,第一节 蛋白质的生物学功能与分类第二节 蛋白质的分子组成第三节 肽第四节 蛋白质的分子结构第五节 蛋白质结构与功能的关系第六节 蛋白质的理化性质与分离纯化,内容提要：,蛋白质(protein)是由许多氨基酸(amino acids)通过肽键(peptide bond)相连形成的高分子含氮化合物。蛋白质是生命活动的物质基础，是含量最丰富的生物大分子，具有多种生物学功能。,第 一 节蛋白质的生物学功能与分类,1.作为生物催化剂酶2.细胞组织构成结构蛋白如微管蛋白、膜蛋白等3.激素功能胰岛素、促甲肾上
2、腺素等4.运动功能肌动蛋白、纤毛蛋白等5.防御功能抗体、干扰素等6.运输功能血红蛋白结合运输氧7.信息传递膜上的受体蛋白8.调节作用转录因子、细胞周期蛋白等9.储存功能种子贮藏蛋白、血浆白蛋白10.糖蛋白肌体保护、载体、信号识别,一、蛋白质的生物学功能,二、蛋白质的分类,难溶于水多数可溶于水,蛋白质的分子组成The Molecular Component of Protein,第 二 节,一、蛋白质的元素组成,主要有C、H、O、N和S。有些蛋白质含有少量P或金属元素Fe、Cu、Zn、Mn、Mo，个别蛋白质还含有 I。,蛋白质的含氮量平均为16，可用于蛋白质定量。,通过样品含氮量计算蛋白质含量的
3、公式：,蛋白质含量(g)=含氮量(g)6.25,蛋白质元素组成的特点,二、氨基酸（amino acid，AA）蛋白质的基本组成单位,在各种生物体中已发现的氨基酸有200余种，但组成人体蛋白质的氨基酸仅有20种，称为蛋白质氨基酸。,氨基酸的结构通式,除脯氨酸是一种亚氨基酸外，其余的都是氨基酸。,氨基酸的结构通式（L-氨基酸）,除甘氨酸外，其它蛋白质氨基酸都是L-氨基酸。,氨基酸中与羧基直接相连的碳原子上有个氨基，这个碳原子上连的基团或原子都不一样，称手性碳原子，当一束偏振光通过它们时，光的偏振方向将被旋转，根据旋转的方向分为左旋和右旋即L型和D型。,（一）氨基酸的分类 根据侧链基团性质,非极性疏
4、水性氨基酸（8种）,侧链R基团极性很小，多为烃基，具有疏水性。,2.极性中性氨基酸（7种）,侧链含有-OH、-SH或-CONH2等极性基团，具有亲水性，但在水溶液中不电离。,介于极性和非极性之间,3.酸性氨基酸（2种）,侧链含有-COOH，能够解离出H+，具有酸性。,4.碱性氨基酸（3种）,侧链有易接受H+的基团而具有碱性，这些基团包括：-NH2、胍基、咪唑基。,胍基,咪唑基,几种特殊氨基酸Gly：无手性碳原子。Pro：为环状亚氨基酸。Cys：可形成二硫键。,习惯分类方法芳香族氨基酸：Trp（色）、Tyr（酪）、Phe（苯丙）含羟基氨基酸：Ser（丝）、Thr（苏）、Tyr（酪）含硫氨基酸：C
5、ys（半胱）、Met（蛋）杂环族氨基酸：His（组）杂环族亚氨基酸：Pro（脯）支链氨基酸：Val（缬）、Leu（亮）、Ile（异亮）,2.稀有蛋白质氨基酸,没有遗传密码，由常见的蛋白质氨基酸渗入多肽链后经酶促修饰形成。,3.非蛋白质氨基酸：以游离或结合的形式存在于生物界，但不是构成蛋白质的成分，即蛋白质中不存在的氨基酸。如：瓜氨酸、鸟氨酸，是代谢途径中产生的。,（二）氨基酸的理化性质,3.两性解离及等电点,2.紫外吸收,4.呈色反应,1.氨基酸的溶解性,1、氨基酸的溶解性,常见-氨基酸均为无色结晶，在水中的溶解度差别很大，能溶解于稀酸或稀碱中，但一般不能溶解于有机溶剂（脯氨酸和羟脯氨酸溶于乙
6、醇或乙醚），故通常用乙醇把氨基酸从其溶液中沉淀析出。氨基酸的味感与其立体构型有关。D-型氨基酸多数带有甜味，甜味最强的是D-色氨酸，甜度可达蔗糖的40倍；L-型氨基酸有甜、苦、酸、鲜等4种不同味感，其中谷氨酸单钠盐是味精的主要成分。,2.氨基酸的紫外吸收,在紫外光区，色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe）有光吸收，其最大吸收波长分别为280nm、275nm和257nm。绝大多数蛋白质中都含有这些氨基酸，所以蛋白质也有紫外吸收能力，一般最大光吸收波长为280nm。利用紫外吸收法可以方便、快速地测定这三种氨基酸的含量；也可用这种方法粗略测定样品中蛋白质的含量。,3.两性解离及等电点
7、,氨基酸分子既含有酸性的-COOH，又含有碱性的-NH2，前者能提供H+变成-COO-，后者能接受H+变成-NH3+。在某一pH值的溶液中，氨基酸解离成的阳离子和阴离子的趋势和程度相等，氨基酸带有等量的正负电荷，即静电荷为零，此时溶液的pH值成为该氨基酸的等电点（isoelectric point，pI）。等电点是氨基酸的特征常数。,pH=pI时，静电荷为零，R+=R-；pHpI时，静电荷为“-”。,氨基酸等电点的计算：侧链不含解离基团的中性氨基酸，其等电点是它的pK1和pK2的算术平均值：pI=(pK1+pK2)/2 同样，对于侧链含有可解离基团的氨基酸，其pI值也决定于两性离子两边的pK值
8、的算术平均值。酸性氨基酸：pI=(pK1+pKR-COO-)/2 碱性氨基酸：pI=(pK2+pKR-NH2)/2 对于碱性氨基酸，只需要将最大的两个值相加/2对于酸性氨基酸，只需要将只需要将最小的两个值相加/2,4.氨基酸的呈色反应,（1）茚三酮反应,（2）Sanger反应,（3）与异硫氰酸苯酯反应,第三节 肽,一、基本概念肽(peptide)：一分子氨基酸的-羧基与另一分子氨基酸的-氨基脱水缩合而成的化合物叫做肽。肽键(peptide bond)：是由一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而形成的化学键。,肽,肽键中的C-N键具有部分双键的性质，不能自由旋转，且肽键中的羰基氧和亚
9、氨基氢呈反式排布，即分居于链的两侧。,二肽、寡肽、多肽：由2个氨基酸通过肽键相连形成的肽叫做二肽（dipeptide）；由此类推，由3个、4个、5个氨基酸通过肽键相连形成的肽叫做三肽、四肽、五肽。通常把含几个至十几个氨基酸残基的肽链统称为寡肽（oligopeptide），更长的肽链称为多肽（polypeptide），把含50个以上氨基酸残基的多肽链称为蛋白质（protein）。但寡肽、多肽、蛋白质之间很难划定严格界限。肽键数目=氨基酸数目-1。,氨基酸残基（amino acid residue）：由于参加肽键的形成，肽链中的氨基酸已经不再具有完整的氨基或羧基，因此称为氨基酸残基。,主链与侧链：
10、多肽链中的肽键通过-碳原子连接而成的线性结构称为多肽链的主链；而多肽链中所有氨基酸残基的R基则称为多肽链的侧链。,氨基端和羧基端：一条多肽链的主链通常在一端含有一个游离的末端氨基，称为氨基端（amino terminal）或N端；在另一端含有一个游离的末端羧基，称为羧基端（carboxyl terminal）或C端。习惯上N端写在左侧，C端写在右侧。,肽平面：多肽链或蛋白分子中，组成肽键的C、O、N、H 4个原子与相邻的2个C原子共处一个平面，称为肽平面（peptide plane）。因肽平面是多肽链主链的重复单位，故肽平面又被称为肽单位（peptide unit）。,肽平面,肽平面,二面角：
11、位于相邻两个肽平面连接处的C，C-N和C-C均为单键，可自由旋转。一个肽平面围绕C-C旋转，旋转角度称；另一个肽平面围绕C-N旋转，旋转角度称。这两个转角决定了相邻两个肽平面在空间的位置，将这两个转角称为二面角。,在多肽链中，由于受R侧链的影响及肽平面本身几何特征的限制，多肽链中的每个C的二面角和的组合都是有限的，因而多肽链实际可能形成的空间构象也是有限的，天然多肽与蛋白分子往往只存在一种或少数几种稳定的构象。,二、几种生物活性肽,1.谷胱甘肽(glutathione,GSH),结构:,谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的三肽谷氨酸的-羧基形成肽键SH为活性基团是体内重要的还原剂,主要功能:,1.作
12、为还原剂，保护体内蛋白质或酶的巯基免遭氧化；2.作为还原剂，清除体内的H2O2；,3.GSH的巯基具有亲核特性，保护核酸和蛋白免遭毒物损害。,肽类激素：如促甲状腺素释放激素（TRH）,神经肽(neuropeptide)：在神经传导过程中起信号传导作用的肽类，如脑啡肽(5肽)、强啡肽(17肽)、内啡肽(31肽)等与痛觉有关。,2.肽类激素及神经肽,蛋白质的分子结构The Molecular Structure of Protein,第 四 节,一、蛋白质的分子结构包括：一级结构(primary structure)二级结构(secondary structure)三级结构(tertiary st
13、ructure)四级结构(quaternary structure),定义：蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸的排列顺序。,二、蛋白质的一级结构,主要化学键：肽键二硫键的位置属于一级结构研究范畴。,一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础。,胰岛素的一级结构,1）样品分离、纯化，均一性鉴定2）测定蛋白质分子量及氨基酸组分3）测定肽链的N端和C端氨基酸4）用两种以上专一性的肽链内切酶裂解成小肽5）用层析、电泳法分离所得小肽6）用Edman方法测定每一小肽顺序7）拼版出多肽序列,蛋白质一级结构测定程序,三、蛋白质的二级结构,蛋白质分子中肽单元（肽平面）的卷曲折叠所形成的某一段肽链的局部空间结构
14、，即该段肽链主链骨架原子的相对空间位置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象。,（一）定义：,稳定因素：氢键,（二）蛋白质二级结构的主要形式,-螺旋(-helix)-折叠(-sheet)-转角(-turn)无规卷曲(random coil),1.-螺旋（-helix）,结构要点:多肽链主链围绕中心轴形成右手螺旋，侧链伸向螺旋外侧。,每圈螺旋含3.6个氨基酸，螺距为0.54nm。因此，相邻两个AA残基的夹角为100，上升0.15nm。,多肽链主链上每个氨基酸残基的C=O与前面第3个氨基酸残基的N-H形成的氢键保持螺旋稳定。氢键与螺旋长轴基本平行。氢键封闭环内包含13个原子。,R基侧链位于螺旋的外侧，可以
15、减少空间位阻效应；但螺旋的形成和稳定性仍受R基侧链的影响。如：-螺旋遇到Pro会中断，因为Pro是-亚氨基酸，空间位阻大，且亚氨基形成肽键后没有H用来形成氢键，以维持螺旋稳定；而Ala易存在于-螺旋中。,-螺旋分为左手-螺旋和右手-螺旋。天然蛋白分子中的-螺旋绝大多数是右手-螺旋，不过在嗜热菌蛋白酶中发现存在一个左手-螺旋。,-螺旋是蛋白质中最常见的一种构象，是在毛发的-角蛋白中发现的，因此叫做-螺旋。,2.-折叠（-sheet）,-折叠是由两条或多条几乎完全伸展的多肽链平行排列，通过链间的氢键进行交联而形成的，或一条肽链内的不同肽段间靠氢键而形成的。肽链的主链呈锯齿状折叠构象。,-折叠的结构
16、特点：,-折叠结构的氢键主要是由两条肽链之间形成的；也可以在同一肽链的不同部分之间形成。几乎所有肽键都参与链间氢键的交联，氢键与链的长轴接近垂直。-折叠有两种类型：一种为平行式，即所有肽链的N-端都在同一边。另一种为反平行式，即相邻两条肽链的方向相反。反平行式的-折叠在蛋白质中存在更普遍。,3.-转角（-turn）,肽链内形成180回折。含4个氨基酸残基，第一个氨基酸残基羰基氧与第四个氨基酸残基的亚氨基氢形成氢键。-转角中常存在Gly和Pro。,-转角：,4.无规卷曲（random coil）除了-螺旋、-折叠、-转角这三种有规则的二级结构外，在球蛋白分子的多肽链主链骨架中还存在一些无确定规律
17、性的盘曲，称为无规卷曲。无规卷曲中的大多数二面角（，）都不相同，因而表现出多种构象，有利于多肽链形成灵活的、具有特异生物活性的球状蛋白分子结构。,影响二级结构形成的因素,氨基酸侧链所带电荷、大小及形状。,影响-螺旋形成的因素：,-折叠形成条件：要求氨基酸侧链较小。,四、超二级结构与结构域,蛋白质分子中，二个或三个具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个具有特殊功能的空间构象，被称为超二级结构或者模体(motif)。,螺旋环螺旋,锌指,纤连蛋白分子的结构域,结构域(domain),大分子蛋白质的三级结构常可分割成一个或数个球状或纤维状的区域，折叠得较为紧密，各行其功能，称为结构域。属于超二
18、级结构。,免疫球蛋白,五、蛋白质的三级结构,是指多肽链在二级结构、超二级结构、结构域的基础上，进一步盘绕、折叠形成的包括主链和侧链构象在内的特征三维结构。即所有原子空间位置。,定义,疏水键：指疏水基团之间的相互作用力；是疏水基团或疏水侧链为避开水分子而相互靠近聚集形成的作用力。是维持蛋白质三级结构最主要的作用力。离子键：又称盐键，是正负离子之间的静电引力。范德华力：实质是静电引力，包括取向力、诱导力和色散力。氢键：主链和侧链之间的氢键也可以维持蛋白质的三级结构。二硫键：多肽链内或不同链间两个Cys残基的巯基在氧化条件下形成二硫键，二硫键是很强的共价键。,维持三级结构稳定的因素：,（2）肌红蛋白
19、的结构特点：a.一条多肽链，153个氨基酸残基，一个血红素辅基。b.肌红蛋白的整个肽链共折叠成8段长短不等的-螺旋（A-H），最长的有23个氨基酸残基，最短的有7个氨基酸残基。拐弯处及C、N末端由无规卷曲组成。c.具有极性侧链的氨基酸残基分布于分子表面，而带非极性侧链的氨基酸残基多分布于分子内部，使肌红蛋白成为可溶性蛋白。,（1）肌红蛋白（Mb）的功能：哺乳动物肌肉中储存氧的蛋白。,肌红蛋白的结构与功能,血红素辅基,肌红蛋白(Mb),六、蛋白质的四级结构,由两条或两条以上具有三级结构的多肽链（亚基）通过非共价键在一起所形成的空间构象，称为蛋白质的四级结构。蛋白质分子中每条具有独立三级结构的多肽
20、链，称为亚基(subunit)。三级结构中只有一条多肽链，不能称为亚基；而四级结构中有多条多肽链组成，每条多肽链称为亚基。,概念：,具有四级结构的蛋白质，其亚基组成可以是相同的，也可以是不同的；单个亚基并没有活性，只有所有亚基在一起时，才具备生物学功能。血红蛋白由两个亚基和两个亚基组成，每个亚基均有与肌红蛋白相似的三级结构，但不具生理活性，只有这四个亚基组成的四聚体（具有了四级结构）才有生理活性。,维持蛋白质四级结构的作用力与三级结构相同，仍是疏水键、氢键、离子键、范德华力等。有些蛋白质（如胰岛素）由两条或多条多肽链组成，但是肽链间通过二硫键（共价键）相连，这些蛋白质不具备四级结构。,蛋白质的
21、四级结构中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用是由分子伴侣参与完成的。,分子伴侣(chaperon),通过提供一个保护环境从而加速蛋白质折叠成天然构象或形成四级结构的一类蛋白质。,血红蛋白（Hb）的结构与功能,（1）血红蛋白的功能：存在动物血液的红细胞中，具有运输O2和CO2的功能。（2）血红蛋白的结构特点：a.是四个亚基的寡聚蛋白，574个AA残基，分子量65KD。b.血红蛋白由两个亚基和两个亚基组成，链由141AA残基、链由146AA残基组成，它们三级结构与肌红蛋白（Mb）相似，各自内部有一个血红素辅基（运输O2的活性部位）。,血红蛋白（Hb）的四级结构,141 aa,146 a
22、a,肌红蛋白与血红蛋白链三级结构比较,蛋白质结构与功能的关系The Relation of Structure and Function of Protein,第 五 节,“物质的结构决定功能，物质结构发生改变功能也会受到影响”“一级结构是空间结构的基础，空间结构改变，功能改变”,一、蛋白质一级结构与功能的关系,一级结构是空间结构和功能的基础。,Glu（谷）的R侧链是带负电荷的亲水基团，而Val（缬）的R侧链是不带电荷的疏水基团。链的第6位AA位于血红蛋白分子表面，导致疏水侧链间相互作用，易于聚集形成纤维状沉淀，使去氧血红蛋白分子溶解度降低，进而是圆盘状的红细胞变成镰刀形，导致运输氧的能力下降
23、，细胞脆性增大，易于破裂、溶血，病情严重可导致死亡。,由于基因突变导致合成失去正常功能的蛋白质或丧失合成蛋白质的能力从而引起的疾病，称为“分子病”（molecular disease）。,一级结构的种属差异与分子进化 细胞色素C是真核细胞线粒体内膜上一种含Fe的蛋白质，在生物氧化中起传递电子的作用。通过植物、动物和微生物等数百种生物的细胞色素C一级结构的研究表明：,（1）亲缘关系越近，AA序列的同源性越大。不同生物与人的细胞色素C相比较AA差异数目 黑猩猩 0 鸡、火鸡 13 牛猪羊 10 海龟 15 狗驴 11 小麦 35 粗糙链孢霉43 酵母菌 44,（2）尽管不同生物间亲缘关系差别很大，但与细胞色素C功能密切相关的AA序列却有共同之处，即保守序列不变。,（一）蛋白质的变性与复性,1.蛋白质的变性概念、表现及及机理 在某些物理和化学因素作用下，蛋白质分子的特定空间构象被破坏，从而导致其理化性质改变和生物活性丧失的过程叫做变性（denaturation）。,二、蛋白质空间结构与功能的关系,造成变性的因素：如加热、有机溶剂、强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂等。,天然状态，有催化活性,尿素、-巯基乙醇,去除尿素、-巯基乙醇,非折叠状态，无活性,牛核糖核酸酶,
