1、解螺旋 陪伴医生科研成长 http:/ 1 流式细胞仪分选细胞流式细胞仪分选细胞 1.1.实验原理实验原理 当经荧光染色或标记的单细胞悬液放入样品管中，被高压压入流动室内。流动室内充满鞘液，在鞘液的包裹和推动下，细胞被排成单列，以一定速度从流动室喷口喷出。在流动室的喷口上配有一个超高频的压电晶体，充电后振动，使喷出的液流断裂为均匀的液滴，待测细胞就分散在这些液滴之中。将这些液滴充以正、负不同的电荷，当液滴流经过带有几千伏的偏转板时，在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中，没有充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。解螺旋 http:/ 将特定的细胞从细胞群体中分选出来。3.3.
2、实验实验材料材料 3.1.3.1.主要试剂主要试剂 试剂试剂 来源来源 Cat.No.Cat.No.人全血单个核细胞分离液 天津灏洋生物制品科技有限责任公司 LDS1075 胎牛血清 Invitrogen 10099141 3.2.3.2.主要仪器主要仪器 仪器名称仪器名称 来源来源 型号型号 离心机 Thermo Micro17R 流式细胞分选仪 BD FACSAria II 超净工作台 北京半导体设备一厂 4 C 冰箱 浙江华美电器制造有限公司 CO2 细胞培养箱 美国 Thermo Fisher 公司 解螺旋 陪伴医生科研成长 http:/ 2 4.4.实验步骤实验步骤 4.1.4.1.
3、样本制备样本制备:(1)获取细胞悬液荧光抗体染色调整细胞浓度(参考 Table 1)避光置冰上运至分选室移入带过滤头的流式管等待分选。解螺旋 http:/ EDTA 抗凝外周血，置于 15 mL 离心管中，并加入等量 PBS 溶液稀释，用吸管充分吹打混匀;2)于另一个 15 mL 离心管中加入等体积 PBMC 分离液 3)将 7 mL 稀释后的全血样品缓慢加入 PBMC 分离液上层，注意:倾斜 45 度缓慢加入，不可用力过大，避免将全血样品混入 PBMC 分离液中;4)置入离心机中，配平，1800 rpm 离心 20 min;5)离心后，缓慢取出离心管，于超净台内用吸管吸去大部分上清液(即血浆
4、)，再用 1 mL 移液枪轻微吸出与白膜层靠近的少部分上清液;6)继续用 1 mL 移液枪将白膜层吸出，转移至另一新的 15 mL 离心管中，加入 10 mL PBS溶液稀释，用吸管充分吹打混匀(目的:尽可能稀释、去除可能混有的 PBMC 分离液和血浆);7)置入离心机中，1800 rpm 离心 10min;8)弃上清，再加入 10 mL PBS，吹打混匀，1800 rpm 离心 10min，留取细胞沉淀，即PBMC 9)PBMC用PBS溶液重悬后，可根据想要分选的细胞类型，选择特定的荧光抗体marker，进行染色，用于后续分析 4.2.4.2.流式仪准备流式仪准备 (1)流式开机(2)无菌分
5、选流程 1)打开 CytometerCleaning ModesPrepare for Aseptic Sort。2)在弹出的对话中，每按照提示操作完一步，均点击 Done。i.无菌准备 鞘液桶灭菌（可高温高压灭菌，亦可酒精消毒。高温灭菌时注意取下液面感应器），并倒入无菌鞘液。解螺旋 陪伴医生科研成长 http:/ 3 DI 桶灭菌 更换 0.2um 鞘液滤器 ii.安装密闭喷嘴，点击“完成”。iii.将漂白水桶液流管与 DI 液流端口相连，点击“完成”。iv.将上面两个液流管复位，点击“完成”。v.将鞘液液流管（不包括滤器）与液流车侧面的液流输出端口相连，点击“完成”。vi.将鞘液液流管从液
6、流车上断开，并装入新的无菌 0.2um 滤器，点击“完成”。vii.将旧的鞘液滤器取下，安装装有无菌滤器的鞘液液流管，点击“完成”。viii.若要接着进行分选实验，点击下图的第一个 Run；若要终止实验、关闭系统并清洗流动室，点击第二个 Run。(3)液流监视 1)用蘸有超纯水的棉签擦拭偏转板，之后用干棉签擦拭干净。整个分选过程都应确保偏转板无液滴或盐结晶。2)打开液流，液流应为一条细线，无分叉、喷雾。关闭液流罩。3)调整仪器小激光的角度，使液流窗中的亮点最亮。4)调整 Ampl 值，使液流断点位置位于窗口中上部。(4)分选液路调整 1)打开 Votage、Test Sort，调整 Ampl
7、值，使液流窗的四个侧液流亮点距离最远、亮点最集中（若只做两路分选，可将两个外侧 Votage Sliders 调至0）。调整完毕后，输入断点液流窗的 Drop1 和 Gap 的实测值，点击 Sweet Sport。解螺旋 http:/ Waste Drawer，调整 Votage Sliders，使侧液流分别流入各自收集管中。关闭 Test Sort、Votage、Waste Drawer。(5)确定液滴延迟（Drop Delay）1)在 Experiment 菜单下选择 New Experiment，选择 Accudrop Drop Delay，点击 OK。2)展开 Specimen_001
8、 与 Tube_001 并激活 Tube_001，双击 Sort Layout_001，界面会出现一个 Sort Layout 对话框 3)两滴 BD Accudrop Beads 溶解在 0.5mlPBS 中上样。将 Window Extension设为零。调整上样速度到 1000-3000 events/秒。4)打开 Votage，点击 sort。此时弹出对话框，提示是否打开 Waste Drawer。因为没有必要收集，所以选择 cancel。5)点击液流窗 Optical Filter，调整 Drop Delay 值，使左框中亮度达到最大。每次调整后要等几秒钟。解螺旋 陪伴医生科研成长
9、http:/ 4 6)在 Sort Layout 窗口将 Initial 改为 Fine Tune,重新调整 Drop Delay，使左框达到最大值（通常接近 99%）。7)调整完毕后，关闭 Optical Filter、Votage、Sort。将 Window Extension恢复为初始值，通常为 2。4.3.4.3.开始细胞分选开始细胞分选 样本和仪器准备完毕，即可进行细胞分选：(1)建立一个新的 Sort Layout。在已有的 Experiment 中，选中 Sort 菜单下的 New Sort Layout。(2)在 Sort Layout 窗口输入合适的选项。从 Device 选
10、项中选择合适的收集装置。从 Precision 选项中选择 Purity。在 Target Events（分选细胞数）下选择数目、输入数字或选continuous 选中分选方向（Left 或 Right），在相应的方向，添加要分选的细胞群（门）。(3)开始分选：放入收集管。上样。设定合适的收集速率。速率低时分选效果比较好。一般 8.0。打开 Votage。解螺旋 http:/ Sort Layout 上的“Sort”。此时出现一个对话框，提示是否打开 Waste Drawer。如果确定开始分选，点击“OK”。如果 Target Events 选择了“Continuous”，仪器将持续分选，直至
11、点击“Sort”或“Acquire”手动停止分选。从 Sort Layout 窗口可监测分选的进度，分选的细胞数显示在相应的区域。在相关的计数区显示分选速率。(4)分选完成 5.5.注意事项注意事项 (1)分选时必须选择合适的喷嘴。应知道细胞的大小与形态，以便选择分选用喷 嘴。所分选细胞的直径最好小于喷嘴直径的 1/5，至少小于 1/3。解螺旋 陪伴医生科研成长 http:/ 5 (2)分选缓冲液使用含 2%FBS 或 BSA 的 PBS，普通培养基中的酚红可能会干扰分选。(3)如细胞分选后需再次培养，建议在 15ml 离心管中加入 1-2ml 血清及其它必需组分，保证分选完毕时血清浓度大于 5%。解螺旋 http:/ 1 1.Bhagwat N,Dulmage K,Pletcher CH,Jr.,et al.An integrated flow cytometry-based platform for isolation and molecular characterization of circulating tumor single cells and clusters.Sci Rep 2018;8 8(1):5035.
