1、动物医学进展,2 0 2 3,4 4(2):5 6-6 0P r o g r e s s i nV e t e r i n a r yM e d i c i n e自拟中药复方与牦牛源地衣芽孢杆菌联合治疗犊牛腹泻的效果 收稿日期:2 0 2 2-0 2-1 5 基金项目:肉牛牦牛产业技术体系(C A R S-3 7);西藏自治区重点研发计划项目(X Z 2 0 2 0 0 1 Z Y 0 0 4 4 N)作者简介:龚赛赛(1 9 9 6-),男,安徽宿州人,硕士研究生,主要从事高原动物疫病防控。*通讯作者龚赛赛1,张 朝1,全楚娴1,周诗萌1,高 兴1,曾智博1,曹 晖3,李家奎1,2*(1.
2、华中农业大学动物医学院,湖北武汉4 3 0 0 7 0;2.西藏农牧学院动物科学学院,西藏林芝8 6 0 0 0 0;3.陕西秦宝牧业股份有限公司,陕西宝鸡7 2 1 0 0 0)摘 要:为了调查陕西某肉牛场犊牛腹泻病因以及探讨自拟中药复方(T CM)和牦牛源地衣芽孢杆菌(B a c i l l u s l i c h e n i f o r m i s,B L)对犊牛腹泻的治疗效果,对1 8份犊牛腹泻样本进行牛轮状病毒(B R V)、牛冠状病毒(B C o V)、牛病毒性腹泻病毒(B V D V)等常见腹泻病原进行P C R检测;将2 0头1 0日龄至3 0日龄中度及以上腹泻犊牛平均分成4个
3、组,另选择同期的5头健康犊牛作为健康对照,N C组和D C组常规饲养,T CM组、B L组和T CM+B L组给与相应治疗药物,共治疗5d。结果表明,引起场区犊牛腹泻的病原主要是B R V和B C o V;自拟复方和牦牛源地衣芽孢杆菌可降低腹泻犊牛的临床评分,改善或恢复腹泻犊牛血清丙氨酸氨基转移酶(A L T)、天门冬氨酸氨基转移酶(A S T)、碱性磷酸酶(A L P)、总蛋白(T P)、白蛋白(A L B)、尿素(UR E A)以及钙(C a)、镁(M g)、无机磷(P)等离子浓度的异常变化。说明自拟复方和牦牛源地衣芽孢杆菌对犊牛腹泻具有良好的治疗效果。关键词:犊牛腹泻;中药复方;牦牛源地
4、衣芽孢杆菌;血清生化中图分类号:S 8 5 7.3文献标识码:A文章编号:1 0 0 7-5 0 3 8(2 0 2 3)0 2-0 0 5 6-0 5 犊牛腹泻是犊牛期的一种消化系统疾病,其主要临床表现为排稀薄或水样粪便,呈黄色、绿色或白色,有恶臭,甚至含有黏膜或便血等,且传染性强,给养牛行业带来巨大的经济损失1。引起犊牛腹泻的原因有很多,除了消化不良及饲养管理不当之外,最重要的原因是病原微生物的感染,如大肠埃希氏菌(E.c o l i)、沙门氏菌(S a l m o n e l l a)、牛轮状病毒(B o-v i n er o t a v i r u s,B R V)、牛冠状病毒(B o
5、 v i n ec o r o n a-v i r u s,B C o V)、牛病毒性腹泻病毒(B o v i n ev i r a l d i a r-r h e av i r u s,B V D V)、隐孢子虫(C r y p t o s p o r i d i u m)、球虫(C o c c i d i a)等2-4。目前,生产上主要使用抗生素防治犊牛腹泻,但抗生素类药物在应用过程中容易产生耐药性,药物残留超标可引起食品安全和公共卫生等问题5,我国已禁止生产含有抗生素等促生长类饲料添加剂的商品饲料6。因此,寻找和开发新的安全、高效、低毒的抗生素替代品便成为当前研究的热点。传统中草药和新兴
6、益生菌可以调节动物机体肠道菌群,促进活性物质的增殖,提高机体免疫力7。研究表明,在犊牛日粮中添加复合益生菌制剂可以显著降低犊牛腹泻率,提高犊牛生长性能8。研究发现9,早期给予犊牛益生菌可改善犊牛肠道健康,调节肠道菌群,抑制病原体定殖,从而减少腹泻病的发生。中草药不仅具备抗菌消炎及调控机体自身免疫等作用,还具有疗效好、低毒、低残留、环 保 和 不 易 产 生 耐 药 性 等 优 点1 0。研 究 表明1 1,传统中药复方补中益气汤、四君子汤和参苓白术汤能够缓解抗生素相关性腹泻,改善肠道菌群。用中药蒲公英、黄连、板蓝根等提取物能有效改善猪流行性腹泻病毒所致的新生仔猪生长性能受损和肠道损伤,减轻腹泻
7、1 2。因此,益生菌和中草药替代抗生素应用于畜牧业腹泻疾病的防控受到越来越多学者的关注。本研究以1月龄以内腹泻犊牛为试验对象,探究牦牛源地衣芽孢杆菌和自拟中药复方对犊牛腹泻的影响,为开发用于防控犊牛腹泻的益生菌制剂和中草药复方提供参考依据。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 试验用动物 1 0日龄至3 0日龄中度及以上腹泻犊牛2 0头,健康犊牛5头,腹泻病料及试验犊牛来自陕西省杨凌示范区某肉牛场。1.1.2 药物和益生菌制剂的准备 自拟中药复方DOI:10.16437/ki.1007-5038.2023.02.004(T CM)及用量(1月龄内犊牛):干姜(3.7 5g)、白术(2.4g)、
8、山药(3.7 5g)、茯苓(2.6g)、白附片(1.3 5g)、丹参(1.1 5g)、党参(3.7 5g)、虎杖(0.7 5g)、佩兰(1.2 5g)、泽兰(1.3 5g)、川芎(1.2 5g)、马尾黄连(0.6 2 5g)、山楂(0.7 2 5g)等中草药用粉碎机打碎成粉按比例混合,加水灌服。牦牛源地衣芽孢杆菌(B L),华中农业大学李家奎教授团队分离保存,经扩大培养后制成干粉制剂,2.5g/次(1 08C F U)溶于水中灌服。1.1.3 主要试剂 S i m p l yP病毒D NA/R NA提取试剂盒B S C 6 7 M 1,杭州博日科技股份有限公司产品;H i S c r i p
9、t O n eS t e pR T-P C R K i t(D y eP l u s)P 6 1 2-0 1,南京诺唯赞生物科技股份有限公司产品;2P r oT a q预混液(含染料)AG 1 1 1 0 9,湖南艾科瑞生物工程有限公司产品;S u p e r R e d/G e l R e d核酸染料B S 3 5 4 A,北京兰杰柯科技有限公司产品。1.1.4 主要仪器 台式冷冻离心机,H e t t i c h公司产品;固定式旋转混匀仪和P C R仪,大龙兴创实验仪器(北京)股份公司产品;电泳仪,北京六一生物科技有限公司产品;蓝光凝胶成像分析系统,北京百晶生物技术有限公司产品;全自动生化
10、分析仪,迈瑞公司产品。1.2 方法1.2.1 病原检测 收集腹泻犊牛粪便样本,干冰低温条件下运输至实验室,在-8 0保存用于病原检测。用无酶水稀释粪便样本至适宜浓度后10 0 0r/m i n离 心4 m i n,取 上 清 液 按 照S i m p l yP病 毒D NA/R NA提取试剂盒、H i S c r i p t O n eS t e pR T-P C RK i t(D y eP l u s)、2P r oT a q预混液(含染料)说明提取核酸并进行病原检测,检测病原及扩增引物见表1。扩增产物经1 0g/L琼脂糖凝胶电泳后在蓝光凝胶成像分析系统下观察结果。表1 引物序列T a b
11、l e1 P r i m e r s e q u e n c e s引物P r i m e r引物序列(5 -3)P r i m e r s e q u e n c e(5 -3)长度/b pL e n g t hB R V-FGA C G GAG C GA C T A C A T NN T3 8 0B R V-RG T C C AAT T C AT A C C T G G T GNB C o V-FG G T AA G C AA T C C AG T AN T A GA3 8 0B C o V-RG G T C C T G T T C C AA GA T AN T AAB V D V-FA
12、T G C C CWT AG T A G GA C T AN C A2 9 9B V D V-RT C AA C T C C A T G T G C C A TN T A C1.2.2 动物分组及处理 健康犊牛5头,中度及以上腹泻犊牛2 0头,平均分为5个试验组,分别为健康对 照 组(N C)、腹 泻 组(D C)、中 药 复 方 治 疗 组(T CM)、牦牛源地衣芽孢杆菌治疗组(B L)、中药复方联合地衣芽孢杆菌治疗组(T CM+B L)。治疗组犊牛给与对应药物,每天2次(早、晚各1次),加水灌服,连续治疗5d,每天上午8时对腹泻犊牛进行一次综合评分。第6天上午所有犊牛空腹采集血样,分离血清
13、,置-2 0冻存用于生理生化指标检测。腹泻犊牛临床评分从粪便状况、精神状况和脱水状况三个方面综合评判,综合评分1分3分、4分6分、7分9分依次判定为轻度腹泻、中度腹泻和重度腹泻。粪便状况评分:粪便正常,形态好(0分),粪便半成型,比正常粪便软(1分),伴有水样,但还是有固体成分可见(2分),完全水样的粪便(3分);精神状况评分:正常的行为表现,动物对环境警觉(0分),轻度抑郁,反应迟钝,但犊牛还能站立和吮吸,不活跃(1分),中度抑郁,能站立或不愿站立呈爬卧状,吮吸很弱或虚弱(2分),严重抑郁,犊牛不能站立和吮吸,侧躺不起(3分);脱水状况评分:正常,眼睛明亮,皮肤柔顺(0分),轻度失水,皮肤弹
14、性稍微丧失,皮肤褶皱试验还原时间3s,眼球凹陷(2分),重度失水,皮肤褶皱试验还原时间6s,眼球明显凹陷(3分)。1.2.3 血清生化指标检测 采用迈瑞全自动生化分析仪B S-2 4 0 V E T对血清样本进行生化指标检测如丙氨酸氨基转移酶(A L T)、天门冬氨酸 氨基转移酶(A S T)、碱性磷酸 酶(A L P)、总 蛋白(T P)、白 蛋 白(A L B)、钙(C a)、镁(M g)、尿素(U R E A)、无机磷(P)。1.2.4 数据处理与分析 血清生化检测结果以xS D表示,通过S P A S S2 0.0数据处理软件进行单因素方差分析,用L S D法进行组间多重比较,以P0.
15、0 5表示组间差异显著。2 结果2.1 腹泻病原P C R检测结果在1 8份腹泻犊牛粪便样本中检测出B R V阳性样本1 1份,阳性率为6 1.1 1%;B C o V阳性样本1 2份,阳性率6 6.6 7%;B V D V未检测出阳性。以上结果表明,该场区犊牛腹泻主要是由B R V和B C o V感染引起的(表2)。表2 腹泻犊牛病原检测T a b l e2 P a t h o g e nd e t e c t i o n i nc a l v e sw i t hd i a r r h e a病原P a t h o g e n样本数/nS a m p l en u m b e r阳性数/n
16、P o s i t i v en u m b e r阴性数/nN e g a t i v en u m b e r阳性率/%P o s i t i v er a t e牛病 毒 性 腹 泻 病毒B V D V1 801 80牛冠状病毒B C o V1 81 176 1.1 1牛轮状病毒B R V1 81 266 6.6 775龚赛赛等:自拟中药复方与牦牛源地衣芽孢杆菌联合治疗犊牛腹泻的效果2.2 腹泻犊牛临床评分变化与腹泻组相比,各治疗组犊牛临床评分均表现下降趋势,且T CM+B L组的犊牛临床评分降低程度最大,经过5d的治疗后评分趋近于0。T CM组犊牛的临床评分降低程度要高于B L组犊牛(图1)。以上结果表明中药和地衣芽孢杆菌能降低腹泻犊牛的临床评分改善犊牛腹泻程度,中药和地衣芽孢杆菌联合使用其降低腹泻犊牛临床评分的能力要高于单一使用。图1 腹泻犊牛每日临床评分F i g.1 D a i l yc l i n i c a l s c o r e so fd i a r r h e i cc a l v e s2.3 血清生化指标变化与N C组相 比,D C组 犊 牛 血 清 中T
