1、 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化中医药疼痛研究电针对慢性炎性疼痛大鼠Wnt/-catenin以及ERK/MAPK信号通路相关蛋白表达的影响桑亚男1，郭现辉1，董升1，王权亮2，张安东1，闫瑞3（1.河南中医药大学第三附属医院 郑州 450000；2.河南省中医药研究院附属医院 郑州 450000；3.阜外华中心血管病医院 郑州 450000）摘要：目的探究电针（EA）对慢性炎性疼痛大鼠Wnt/-catenin信号
2、通路和ERK/MAPK信号通路的调控作用。方法通过完全弗氏佐剂建立慢性炎性疼痛大鼠（CFA）模型。实验分为4组：对照组（NS组）、模型组（CFA组）、模型组+电针组（CFA+EA组）和模型组+假电针组（CFA+Sham EA组），每组6只大鼠。模型建立8天后进行EA治疗，每天1次，每次30 min。用Up-down法评价机械痛阈值，用丙酮刺激大鼠致炎足底观察冷刺激诱发痛的反应评分，用ELISA检测血清和左后足组织中前列腺素E2（Urinary prostaglandin E2，PGE2）、白介素-6（Interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子-（Tumor necrosis fact
3、or-，TNF-）、白介素-1（Interleukin-1，IL-1）和脑源性神经营养因子（Brain-derived neurotrophic factor，BDNF）的表达水平，用Western blot检测左后足组织中Wnt家族成员1蛋白（Wnt family member 1，Wnt-1）、连环蛋白（catenin beta 1，-catenin）和糖原合酶激酶-3（Glycogen synthase kinase-3 beta，GSK-3）的表达水平以及cAMP反应元件结合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB）和细胞外信号调节激酶
4、（Extracellular signal-regulated kinase，ERK）蛋白的磷酸化水平。结果与CFA模型组相比，治疗后第5天及第7天，EA显著提高了CFA大鼠的机械痛阈值（P0.05），并显著降低了CFA大鼠的冷刺激评分（P0.05）。此外，EA显著降低了CFA大鼠血清和左后足组织中PGE2、IL-6、TNF-、IL-1和BDNF的表达水平和左后足组织中Wnt-1和-catenin的蛋白表达水平以及CREB和ERK蛋白的磷酸化水平（均P0.05），并显著升高了左后足组织中GSK-3的蛋白表达水平（P0.05）。结论EA显著改善了大鼠慢性炎性疼痛，其机制可能与抑制Wnt/-cat
5、enin信号通路和ERK/MAPK信号通路有关。关键词：电针 Wnt/-catenin信号通路 ERK/MAPK信号通路 慢性炎症 疼痛 完全弗氏佐剂doi:10.11842/wst.20211103008 中图分类号:R285.5 文献标识码:A慢性炎症疼痛是临床上最常见的病理性疼痛之一，引起的持续性疼痛会对患者身心造成严重影响。慢性疼痛的经历会影响个体的生理状态，即使在疼痛感觉已经恢复之后，有慢性疼痛经历的受试者通常对随后的较低疼痛表现出增强的反应1。目前常用的疼痛治疗药物为各类抗炎药和镇痛药，但长期使用会产生不同程度的副作用。针灸镇痛已被广泛用于缓解多种疼痛，特别是慢性疼痛。虽然已有研究
6、表明针灸可以通过抗氧化途径，神经保护和抗炎途径产生镇痛作用2，但目前针刺镇痛的机制仍不完善。Wnt-1和-catenin是经典Wnt/-catenin信号通路的关键蛋白，已有研究表明，Wnt/-catenin信号通路以及相关蛋白的表达与炎症反应密切相关3-4。此外，在神经系统发育过程中，Wnt蛋白家族在调节轴突 收稿日期：2021-11-03 修回日期：2022-05-25 河南省中医管理局普通课题（2019ZY2102）：功能训练结合医用臭氧水穴位及关节腔注射治疗膝骨关节炎的疗效评价及机理研究，负责人：王权亮。通讯作者：闫瑞，硕士，主任医师，主要研究方向：心血管病方向。4427 Modern
7、ization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2022 第二十四卷 第十一期 Vol.24 No.11 再生和神经性疼痛的发病机制中起着重要作用5。Wnt信号通路的激活可刺激促炎因子TNF-和IL-1的分泌，加剧神经性疼痛6-8。Wnt或-catenin的活化都可以促进脑源性神经营养因子（BDNF）表达，然后加重神经疼痛9-11。然而针灸治疗慢性疼痛的机制是否与Wnt/-catenin信号通路的调控有关仍不清楚。CREB 和 ERK 蛋白都与各种类型的疼痛传递有关1
8、2，例如神经性疼痛、糖尿病神经病变疼痛、或者辣椒素诱导的疼痛。CREB和ERK蛋白属于丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族，通过调节背根神经节（DRG）、脊髓和大脑皮层的神经元可塑性和炎症反应导致疼痛超敏反应13。在慢性疼痛的外周和中枢神经系统中都存在MAPKs的过度磷酸化14-15，而抑制MAPKs会减弱神经元兴奋性并缓解疼痛16-17。然而，ERK/MAPK信号通路在针灸治疗慢性疼痛中的作用尚不清楚。因此，本研究建立慢性炎性疼痛大鼠模型，旨在探究电针（Electroacupuncture，EA）干预治疗对 Wnt/-catenin信号通路和ERK/MAPK信号通路的影响，进一步明确针刺消炎镇
9、痛可能的分子机制。1 材料与方法 1.1实验动物健康的SPF级雄性SD大鼠，体质量200-250 g，购自成都达硕实验动物有限公司，合格证号：20190078。所有大鼠均正常饮食饮水。1.2试剂与仪器前列腺素 E2（PGE2）ELISA 试剂盒（Elabscience，54J6AM7NFP）、白 介 素-6（IL-6）ELISA 试 剂 盒（Abcam，ab234570）、IL-1 ELISA 试 剂 盒（Abcam，ab255730）；兔抗 Wnt-1、兔抗-catenin 和兔抗 GSK-3（Abcam，ab15251、ab32572 和 ab32391）；兔 抗CREB、兔 抗 p-CR
10、EB、兔 抗 ERK 和 兔 抗 p-ERK（Abcam，ab32515，ab32096，ab184699和ab76299）。ZE5 Bio-Rad 全能型成像系统（Bio-Rad，USA）；MK3 酶标仪（Thermo，USA）；NC12775 Von-Frey 纤维丝测痛仪（上海玉研科学仪器有限公司，中国）。1.3方法1.3.1实验动物分组建模前 1 天，将 SD 大鼠置于特制的有机玻璃箱内，适应环境30 min后，对大鼠进行机械痛觉测试，剔除疼痛阈值异常（疼痛阈值过高或过低）的大鼠后分组进行实验。选出6只大鼠作为对照组，再将剩余的大鼠进行 CFA 造模，造模成功后，将大鼠随机分为3组，每
11、组6只，组间大鼠体重没有显著性差异，具体分组为：模型组、模型+电针组和模型+假电针组。1.3.2CFA动物模型根据文献方法建立CFA动物模型18：腹膜内注射3%戊巴比妥钠（50 mg/kg）对大鼠进行麻醉，给实验组大鼠左后足皮下注射100 L完全弗氏佐剂诱发足底内炎症，对照组注射100 L生理盐水。造模7天后，与未造模组比较，造模组大鼠左后足出现明显的红肿，并且活动行为明显减少，则造模成功。1.3.3电针（EA）治疗在CFA大鼠模型建立后第8天，对EA治疗组大鼠左后肢足三里（ST36）和阳陵泉（GB34）进行电针治疗，ST36 位于膝关节后外侧，腓骨小头下约 5 mm 处，GB34位于距ST3
12、6上外侧5 mm处，穴位定位标准参照实验针灸学19），针灸针置于大鼠肌肉层（2-3 mm），刺激参数选用疏密波，频率2/100 HZ，强度0.5-1.5 mA（每10 min增加0.5 mA），每次治疗30 min，连续电针治疗7天，每天在同一时间（上午9 00-11 00）进行。实验中4组大鼠均在没有麻醉的情况下被固定在固定装置内，除电针治疗处理外，其余操作完全相同。不同处理为对照组和模型组不进行电针治疗，模型组+假电针组针灸针置于大鼠肌肉层（1 mm），但不进行通电治疗。1.3.4大鼠一般情况观察观察大鼠一般情况，包括大鼠的精神状态、饮食饮水、步态和足底红肿程度。1.3.5Up-down法
13、检测机械痛在实验前3天取实验大鼠提前适应Up-down法环境，每次 20 min。用 VonFrey针刺触觉测量套件刺激大鼠左后足，Up-down法检测和计算大鼠机械痛阈，详细步骤为：将大鼠置于镂空的行为检测钢丝网上适应后，然后序贯采用 1.4、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、15.0、26.0 g的Von Frey细丝垂直检测各组大鼠足底疼痛阈值，若出现缩足、舔足、抬足等行为，则表明该Von Frey细丝对应规格为此时大鼠足底疼痛阈值。检测时间点在EA治疗的前1天（T0）、第1天（T1）、第3天（T3）、第5天（T5）和第7天（T7）记录大鼠机械痛变化。1.3.6化学刺激法检测冷刺
14、激痛觉超敏反应在检测机械痛30 min后，以0.2 mL丙酮快喷射大4428 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化中医药疼痛研究鼠左后足，观察大鼠的应激反应情况，根据其对冷刺激的反应进行冷刺激评分，没有任何反应者为0分；轻抬受刺激的后足为 1 分；反复剧烈抬、摇晃后足为2分；持续或反复撤足并舔爪、摇爪或大叫者为3分20。于EA治疗的前1天（T0）、第1天（T1）、第3天（T3）、第5天（T5）和第7天（T7）记录大鼠冷
15、刺激评分。1.3.7ELISA检测血清和左后足组织中PGE2、IL-6、TNF-和IL-1的表达实验最后1天，在行为学测试结束后1 h，大鼠麻醉后腹主动脉取血，4，5000 r/min离心10 min后取血清；取致炎足足底组织，冰浴研磨，制备组织匀浆，3000 r/min离心15 min，取上清。ELISA法检测上清和血清中PGE2、IL-6、TNF-、IL-1和BDNF的含量，具体操作参考试剂盒说明书。1.3.8Western blot检测左后足组织中相关蛋白的表达水平取大鼠左后足组织，PBS清洗，加裂解液，冰浴研磨，离心后收集上清，Bradford 法测定蛋白浓度。取25 g蛋白，进行SD
16、S-聚丙烯酰胺凝胶电泳，并转移至PVDF 膜，然后进行 TBST 清洗、一抗孵育（Wnt-1，1 1000；-catenin，1 5000；GSK-3，1 5000；CREB，1 1000；p-CREB，1 5000；ERK，1 10000；p-ERK，1 10000）、TBST清洗、二抗孵育（抗兔HRP标记的二抗，1 5000，Santa Cruz Biotechnology）、TBST 清洗等常规Western blot操作步骤，最后加入超敏发光底物曝光，使用Image J分析蛋白相对表达水平，-actin为内参。1.4统计学分析采用 GraphPad 8.0 统计软件对实验结果进行分析，实验结果用均值标准差（x s）表示。本实验中数据均呈正态分布，对照组和模型组采用T检验，模型组、电针组和假电针组三组间采用单因素分析，方差齐性，事后检验采用Tukey做事后分析，方差不齐，事后检验采用Dunnetts做事后分析。P0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1电针治疗对慢性炎性疼痛大鼠大体情况的影响四组大鼠精神状态都表现良好，饮食饮水正常。正常组大鼠未发现明显异常状况，其余三组小鼠造模
