1、 解螺旋 陪伴医生科研成长 http:/ 1 miRNAmiRNA-qPCRqPCR 检测实验检测实验 1.1.实验原理实验原理 在单管 PCR 的扩增和测定步骤结合使用荧光指示染料。含量的测定依赖于测定增加的荧光信号，其强度与每一次 PCR 循环的产物量成正比。此外，在单次反应中，用不同染料标记的探针能够监测和定量多标记的目的基因。在一次循环中，单次 PCR 荧光第一次超过既定的或背景荧光阈值，这个参数就称为循环阈值(Ct)或交叉点(Cp).起始浓度越高，Ct 值越小。当维持 PCR 分析滴定终点敏感性和特异性时，这种荧光和扩增物的相关性使目的基因能够在一个较大的范围内被精确定量。解螺旋 h
2、ttp:/ 检查 miRNA 表达水平。3 3.实验实验材料材料 3 3.1.1.主要试剂主要试剂（试剂来源仅供参考）（试剂来源仅供参考）试剂试剂 来源来源 Cat.No.Cat.No.Trizol Invitrogen 1596-026 三氯甲烷（氯仿）国药集团化学试剂有限公司 10006818 Dnase/RNase-FREE Water Solarbio R1600 异丙醇 国药集团化学试剂有限公司 80109218 乙醇 国药集团化学试剂有限公司 10009218 DEPC 处理的水 JRDUN JRD04320SD PCR 无色薄壁管（平盖）AXYGEN US-PCR-02-C Ta
3、qMan MicroRNA Reverse Transcription Kit TaqMan 2 Universal PCR Master Mix,5mL TaqMan MicroRNA Assays(20 x)6xloading buffer TaKaRa 解螺旋 陪伴医生科研成长 http:/ 2 dNTP promega U1240 Rnase Inhibitor promega N2115 无菌 PBS（无 Ca2+、Mg2+）GXD 封膜 Bio-Rad MSB1001 琼脂糖（Agarose）Biowest 溴化乙锭（EB)上海生工 3 3.2.2.主要仪器主要仪器（仅供参考）（仅
4、供参考）仪器名称仪器名称 来源来源 型号型号 离心机 Thermo Micro17R 荧光定量 PCR 仪 Roche LightCycler 480 微量紫外-可见光分光光度计 赛默飞 NanoDrop2000 电泳仪 上海天能 EPS-300 凝胶成像系统 上海天能 Tanon-5200 制冰机 浙江德宝 匀浆器（电动或手动）涡旋振荡器 南京瑞麦 普通 PCR 扩增仪 ABI ABI 9600 型 3.33.3 qPCRqPCR 引物引物 一般可让公司设计，也可以自己设计，设计步骤详见解螺旋酸谈实验室教程（视频教程）。4 4.实验步骤实验步骤 整个实验操作在超净工作台中进行，操作前对台面进
5、行 20min 的紫外照射灭菌消毒，相关实验器材 75%乙醇擦拭消毒。除特殊说明外，所有的操作在室温的条件下完成。4.14.1 RNARNA 抽提抽提 （1 1）细胞细胞样品的裂解样品的裂解 解螺旋 http:/ 6 孔板中加入 1ml Trizol/孔，匀速吹打后室温静置 5min，转移至新的 1.5 ml 解螺旋 陪伴医生科研成长 http:/ 3 Eppendorf 管中。2）每管加入 200 l 氯仿，用手振摇 Eppendorf 管 15 秒，室温静置 10min，4，12000 rpm，离心 15min。3）此时管内物质分成三层，使用 1000l 枪头吸取上层液体 400l，移至新
6、的 1.5 ml Eppendorf管，每管加入200 l氯仿，用手振摇Eppendorf管15秒，室温静置10min，4，12000 rpm，离心 15min。a)使用 200l 枪头吸取上层液体 200l，移至新的 1.5 ml Eppendorf 管，加入与所取的上层水相等体积预冷的异丙醇，混匀后 4静置 10 min，4，12000 rpm 离心 10 min。b)此时管中出现白色沉淀，为实验需要的总 RNA，使用 1000l 枪头吸去上清。c)加入 1 ml 75%乙醇（用 DEPC 处理过的水新鲜配制），洗涤沉淀，4，10000 rpm离心 5 min。d)使用 1000l 枪头吸
7、去上清，4，10000 rpm 离心 5 min。e)用 20l 的枪头小心吸去残余的水分，室温干燥，待 RNA 基本透明时，加入20l Nuclease-free water，至完全溶解。（2 2）组织样本组织样本 RNARNA 提取提取 解螺旋解螺旋 http:/ EP 管，称取新鲜组织样本或液氮冰冻组织样本约 50100 mg，置于冰上。b)加入 1 ml TRIzol试剂，用电动匀浆器于室温破碎组织，液氮冰冻组织称取后立即于 TRIzol试剂中匀浆，不同组织之间需要用去离子水清洗电动匀浆器的探头，避免组织间交叉污染。c)匀浆后至于室温轮转 5 min，使组织充分裂解，期间可用枪头反复吹
8、打促进裂解。d)加入 0.2 ml 氯仿，用手剧烈上下振荡 15 s，室温静置 23 min。e)离心 4 12000g 15 min，上清水相移至一新 EP 管，加入 0.5 ml 100异丙醇，混匀后室温放置 10 min 沉淀 RNA。f)离心 4 12000g 10 min，1ml 75乙醇洗涤沉淀 1 次，4 7500g 离心 5 min。g)弃去乙醇，室温风干 510min，RNA 沉淀溶于 2050l RNase-free 水中；h)血液样本 RNA 提取 解螺旋 陪伴医生科研成长 http:/ 4 i)血样保存：EDTA 抗凝血样 0.4ml 加入 1.3mlRNA later
9、 中充分混匀，程序冻存至-80暂存。j)血样融化，瞬离，混匀，取 850 l 血样移入 2 ml EP 管中，加入（等体积）850 l 预冷 PBS（4保存），12000r 4离心 5 min，弃上清留沉淀（吸水纸控干）。k)将剩余血样移入沉淀中，再加（等体积）850 l 预冷 PBS，12000r 4离心 5 min，彻底弃上清留沉淀（吸水纸控干）。l)加 1 ml Trizol，每加一个手摇几次或用枪头吹打几下，避免大团块的产生，随后涡旋约 1-2min 至无较大团块（团块大会堵塞枪头，不易吹打），吹打混匀30 次，吹打前颠倒混匀几下（使沉淀变少）再吹打，吹打至无絮状沉淀（必须充分吹打混匀
10、）。m)加入 1 l（0.25M）外参应用液（原液稀释 100 倍成为应用液），混匀，室温静置 5min。解螺旋 http:/ 200 l 氯仿（Trizol：氯仿=5:1），盖紧盖子，剧烈振荡 30 次，12000r，4，离心 8min.o)小心取上清（切勿吸到下层沉淀）于事先标好号的 1.5ml EP 管，加入与上清体积相等的异丙醇，（再加入 1.5l 的糖原）此步根据实际情况来定（可以加也可以不加），颠倒混匀，室温放置 10min，-4放置 15min，12000r，4，离心 25min.p)用枪头吸出上层液体，管底留大概 50-100l，防止不小心吸出沉淀，加入 1ml 75%乙醇（用
11、无水乙醇和 RNase-free ddH2O 配制），颠倒混匀，13600r，4，离心 10min，用枪头小心洗出 1ml 液体（勿插入底部），余下 13600r，4，离心 1min（方便壁上乙醇吸出以及挥发）。q)用枪头小心吸出余下乙醇，晾干（切记不能放置太久），加入 20l RNase-free ddH2O，溶解 RNA，涡旋 5s，置于冰上，进行定量。(加入水的量根据预实验提出来的实际浓度来定，浓度太低可以减少加水量至 17l。4）测定浓度：取 1 l RNase-free ddH2O BLANK，取 1l RNA 用 NanoDrop2000 测定浓度。测完所有样本记得用 ddH2O
12、清洗。5）反转录制备 cDNA a)将 TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit 从-20冰箱中取出，放置 5 分 解螺旋 陪伴医生科研成长 http:/ 5 钟，使其解冻。b)将试剂盒中各种成分预混，每 15ul 反应体系需要加入 7ul 预混液，混匀，放入离心机离心 30 秒。预混液各成分如下：试剂名称 剂量（ul）100mM dNTPs（with dTTP）0.15 MultiScribe Reverse Transcriptase 1 10Reverse Transcription Buffer 1.5 RNase Inhibitor 0.19
13、 Nuclease-free water 4.16 Total 7 c)将反应管编号，将 RT primer tube 从-80冰箱中取出，放在室温下溶解，每 15ul反应体系中加入相应 3ul primer。解螺旋 http:/ 15ul 反应体系中加入 5ul RNA sample。e)把反应管盖好盖子，放入 PCR 仪。f)设置反应温度及相应时间，如下：温度（）时间（分钟）16 30 42 30 85 5 4 1 g)反应结束后，把反应管取出，放入 4冰箱冻存备用。6）荧光定量 PCR(qRT-PCR)a)将反应管编号，每个反应管中加入 10.00 ul TaqMan 2 Univers
14、al PCR Master Mix和 7.67 ul Nuclease-free water 混匀。b)每个反应管中加入相应 TaqMan MicroRNA Assay 1ul。c)每个反应管中加入相应RT reaction product 1.33 ul。每 20ul 反应体系如下：试剂名称 剂量（ul）TaqMan MicroRNA Assay（20）1.00 Product from RT reaction 1.33 TaqMan 2 Universal PCR Master Mix 10.00 Nuclease-free water 7.67 解螺旋 陪伴医生科研成长 http:/ 6
15、 Total 20 d)将反应管密封，放入 PCR 反应仪，设置反应条件：95 10 min 预变性，95 15 s，60 60 s，共 55 个循环。e)每次检测均设立空白阴性对照(NTC)、阳性对照，每个标本采用三个复孔。反应结束后，电脑自动得出熔解曲线。7）琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 扩增产物 a)将制胶板洗净、干燥，水平放置于工作台上。b)插入梳子。c)称取 4.0g 琼脂糖于 100ml 1xTAE 缓冲液中，在微波炉中使琼脂糖颗粒完全溶解，冷却至 4550时倒入制胶板中。d)凝胶凝固后小心拔去梳子。e)将制胶板放入电泳槽中，加入电泳液，将 10ul PCR 扩增产物与 2ul 6x
16、loading buffer 混合后依次点入加样孔中。f)打开电泳仪，调整电压 120V，电流 400mA，时间 30min，使样品向正极移动。g)电泳完成后切断电源，取出凝胶，放入溴化乙锭（EB）溶液中染色 25min，清水漂洗后置于天能凝胶成像系统中观察电泳结果并照相记录。5.5.注意注意事项事项 解螺旋解螺旋 http:/ TRIzol试剂的 10，否则容易有 DNA 污染；RNA 如不易于溶解，可至于 5560水浴锅中 1015 分钟，促进溶解。6 6.典型文献典型文献1 1 1.Kim KC,Yun J,Son DJ,et al.Suppression of metastasis through inhibition of chitinase 3-like 1 expression by miR-125a-3p-mediated up-regulation of USF1.Theranostics 2018;8 8(16):4409-28.
