1、1/8mRNA 的分离纯化【实验原理】真核生物的 mRNA 分子是单顺反子，是编码蛋白质的基因转录产物。真核生物的所有蛋白质归根到底都是 mRNA 的翻译产物，因此，高质量 mRNA 的分离纯化是克隆基因、提高cDNA 文库构建效率的决定性因素。哺乳动物平均每个细胞含有约 1x10-5g RNA，理论上认为每克细胞可分离出 510mg RNA。其中 rRNA 为 75 85，tRNA 占 1016，而 mRNA 仅占 1%5，并且 mRNA 分子种类繁多，分子量大小不均一，表达丰度也不一样。真核生物 mRNA 有特征性的结构，即具有 5端帽子结构（m7G）和 3端的poly(A)尾巴绝大多数哺
2、乳动物细胞的 3端存在 20300 个腺苷酸组成的 poly（A）尾，通常用 poly（A+）表示，这种结构为真核 mRNA 分子的提取、纯化，提供了极为方便的选择性标志，寡聚（dT）纤维素或寡聚（U）琼脂糖亲合层析分离纯化 mRNA 的理论基础就在于此。一般 mRNA 分离纯化的原理就是根据 mRNA 3末端含有多 poly(A)尾巴结构特性设计的。当总 RNA 流经寡聚（dT）（即 oligo(dT)）纤维素柱时，在高盐缓冲液作用下，mRNA 被特异地吸附在 oligo(dT)纤维素柱上，在低盐浓度或蒸馏水中，mRNA 可被洗下，经过两次 oligo(dT)纤维素柱，即可得到较纯的 mRN
3、A。目前常用的 mRNA 的纯化方法有：（1）寡聚（dT）纤维素柱层析法，即分离 mRNA 的标准方法；（2）寡聚（dT）纤维素液相离心法，即用寡聚（dT）纤维素直接加入到总的RNA 溶液中并使 mRNA 与寡聚（dT）纤维素结合，离心收集寡聚（dT）纤维素mRNA复合物，再用洗脱液分离 mRNA，然后离心除去寡聚（dT）纤维素；2/8（3）其它一些方法：如寡聚（dT）磁性球珠法等。本实验应用方法（1）进行 mRNA 的分离纯化。【试剂与器材】（一）试剂1 0.1mol/L NaOH，每组 200mL2 寡聚 Oligo（dT）-纤维素3 加样/洗涤缓冲液 1：0.5 mol/L NaCl,2
4、0 m mol/L Tris-HCl(pH 7.6)，每组 250mL或 0.5mol/L NaCl,20mmol/L Tris-HCl(pH7.6),1mmol/L EDTA(pH8.0),0.1%SDS。4 洗涤缓冲液 2：0.1 mol/L NaCl,20 m mol/L Tris-HCl(pH 7.6)，每组 250mL 或10mmol/L Tris-HCl(pH7.6),1mmol/L EDTA(pH8.0),0.05%SDS。配制时可先配制 Tris-HCl(pH 7.6)、NaCl、EDTA（pH 8.0）的母液，经高压消毒后按各成分确切含量，经混合后再高压消毒，冷却至 65时，
5、加入经 65温育（30min）的 10%SDS 至终浓度。5 5 mol/L NaCl，每组 10mL6 3 mol/L NaAc pH5.2，每组 10mL7 无 RNase 双蒸水(DEPC 水)，每组 100mL8 70%乙醇，每组 10mL注意：溶液 5，6 的配制都应该加 0.1%DEPC 处理过夜，溶液 1，3，4，8 则用经 0.1%DEPC处理过的无 RNase 双蒸水配制，Tris 应选用无 RNase 的级别。溶液配制后，最好能够按一次实验所需的分量分装成多瓶（如 10ml 或 50ml/瓶）保存，每次实验只用一份，避免多次3/8操作造成对溶液的污染。（二）器材1 恒温水浴
6、箱2 冷冻高速离心机3 紫外分光光度计4 巴斯德吸管5 玻璃棉6 5ml 一次性注射器【操作方法】（一）oligo(dT)纤维素的预处理1 用 0.1mol/L NaOH 悬浮 0.5-1.0g oligo(dT)纤维素。2 将悬浮液装入填有经 DEPC 水处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床体积为 0.5-1.0mL，用 3 倍柱床体积的无 RNase 的灭菌双蒸水冲洗 oligo(dT)纤维素。3 用 3-5 倍柱床洗涤缓冲液 I 冲洗 oligo(dT)纤维素，直到流出液的 pH 值小于 8.0。4 将处理好的 oligo(dT)纤维素从巴斯德吸管倒出，用适当的柱床洗涤缓冲液 I
7、 悬浮，浓度约为 0.1g/mL，保存在 4待用。（二）总 RNA 浓度的调整1 把实验一所提的总 RNA 转到适合的离心管中，如果总 RNA 的浓度大于 0.55mg/mL，则用无 RNase 的双蒸水稀释至 0.55mg/mL，总 RNA 的浓度对除去 rRNA 是很重要的。把4/8RNA 溶液置于 65水浴加热 5 分钟，然后迅速插在冰上冷却。2 加入 1/10 体积 5 mol/L NaCl 使 RNA 溶液中盐的浓度调至 0.5 mol/L。（三）mRNA 的分离1 mRNA 与 Oligo(dT)-纤维素结合：用移液器重新悬浮 oligo(dT)-纤维素，按下表取适量的 oligo
8、(dT)-纤维素到 RNA 样品中，盖上盖子，颠倒数次将 oligo(dT)-纤维素与 RNA混匀。于 37水浴保温并温和摇荡 15 分钟。总 RNA(mg)寡聚 Oligo(dT)-纤维素(mL)洗涤缓冲液 1，2(mL)洗脱体积(mL)0.20.21.01.00.2-0.50.51.51.50.5-1.01.03.03.01.0-2.02.05.05.02 转移：取 1 个 5ml 的一次性注射器，取适量经过高温灭菌的玻璃棉塞紧前端，并把它固定在无 RNase 的支架上，再把 oligo(dT)-纤维素/RNA 悬浮液转移到注射器，推进塞子直至底部，把含有未结合上的 RNA 液体排到无 R
9、Nase 的离心管中（保留至确定获得足够的 mRNA）。3 洗涤：根据上表直接用注射器慢慢吸取适量的洗涤缓冲液 1，温和振荡，充分重新悬浮mRNA-oligo(dT)-纤维素，推进塞子，用无 RNase 的离心管收集洗出液。测定每一管的OD260，当洗出液中 OD 为 0 时准备洗脱。4 洗脱：根据上表直接用注射器慢慢吸取适量（2-3 倍柱床体积）的洗脱缓冲液 2 或无5/8RNase 双蒸水到注射器内充分重悬 mRNA-oligo(dT)-纤维素，推进塞子以 1/3 至 1/2 柱床体积分管收集洗脱液。5 测定每一管的 OD260，合并含有 RNA 的洗脱液组分于 4，2500g，离心 2-
10、3 分钟，上清转移至新的离心管中，去掉残余的 oligo(dT)-纤维素。6 沉淀：洗脱液中加入 1/10 体积的 3mol/L NaAc（pH5.2）,再加入 2.5 倍体积的冰冷乙醇，混匀后，-2030 分钟或放置过夜。7 离心收集：12000g,4离心 15 分钟，小心弃去上清，mRNA 沉淀此时往往看不见，用 70%乙醇漂洗沉淀，12000g,4离心 5 分钟，小心弃去上清液，沉淀空气干燥 10 分钟，或真空干燥 10 分钟。将 mRNA 沉淀溶于适当体积的无 RNase 的双蒸水，立即用于 cDNA合成（或保存在 70%乙醇中并贮存于-70）。8 定量：测定 OD260 和 OD28
11、0，计算产率以及 OD260/OD280 的比率（同上一实验）。【注意事项与提示】1 整个操作过程必须严格遵守无 RNase 操作环境规则。2 提取的总 RNA 必须完整，不能被降解，这是 mRNA 质量的先决条件。3 总 RNA 与 Oligo(dT)-纤维素的比例要适当，过量的总 RNA，容易造成 mRNA 不纯。4 RNA 溶液与 Oligo(dT)-纤维素结合前必须置于 65加热 5 分钟，这一步很重要，其作用（1）破坏 mRNA 的二级结构，特别是 poly(A+)尾处的二级结构，使 poly(A+)尾充分暴露，提高 poly(A+)RNA 回收率；（2）解离 mRNA 与 rRNA
12、 的结合。加热后应立即插入冰上，以免由于温度的缓慢下降使 mRNA 又恢复其二级结构。5 应注意 mRNA 不能被 DNA 污染，即使是 1 ppm DNA 污染，也可严重影响实验结果。6 mRNA 制备后，可用变性琼脂糖凝胶电泳捡测其完整性和有无 DNA 污染。提取的6/8mRNA 应该在 0.58.0kb 之间呈现弥散状，无明显区带，但大部分的 mRNA 应在 1-2.0kb范围内（如下图）。一般来说，经过一次纯化分离的 mRNA 还会有微量的 rRNA 残留，但一般来说不会对后续实验造成很大的影响，如果样品充足，可将经过一次纯化分离的 mRNA再纯化一次，进一步提高其纯度。图 3.1mR
13、NA 变性琼脂糖凝胶电泳示意图Lane 1,0.247.5kb RNA 分子量 Maker;Lane 2,老鼠肝脏总 RNA;Lane 3,老鼠肝脏 mRNA7 为防止 mRNA 降解，应避免多次冻融，可将 mRNA 少量分装后保存。另外，如果有低温冰箱,最好在-70-80保存。也可将 mRNA 在 70%乙醇中-70保存一年以上。8 寡聚(dT)纤维素柱用后可用 0.3mol/l NaOH 洗净，然后用层析柱加样缓冲液平衡，并加入 0.02%叠氮钠（NaN3)冰箱保存，重复使用。每次用前需用 NaOH、灭菌 ddH2O、层析柱加样缓冲液依次淋洗柱床。9 一般而言，107 哺乳动物培养细胞能提
14、取 1-5g Poly(A+)RNA，约相当于上柱总 RNA量的 1%-2%。7/8【实验安排】1 第一天：试剂的配制和所用一次性塑料制品和玻璃器皿的去 RNase 处理（0.1%DEPC浸泡或高温干烤）。2 第二天：进行（一）、（二）和（三）1-6。3 第三天：进行（三）7 和变性琼脂糖凝胶电泳捡测 mRNA。4 为了避免由于保存时间过长造成的 RNA 降解，最好能将总 RNA 提取、mRNA 的分离纯化、RT-PCR 和 cDNA 文库构建实验安排在连续的时间内进行。其他：引物的设计一般遵循的原则：1）典型的引物 20-24 个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的
15、序列位点的可能性。但是太长的引物可能会与错误配对序列杂交降低了特异性，同时因为 比短序列杂交慢，从而降低了产量。2）设计 5端和中间区为 G 或 C，且 GC 含量为 5060的引物，以增加引物的稳定性及其与目的序列杂交的稳定性。3）3末端尽量不要富含 GC。设计引物时保证在最后 5 个核苷中含有 3 个 A 或 T。但因为3端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸，为了避免 3末端的错误配对，所以末端尽量避免为核苷 A。4）在引物对 3末端尽量避免互补序列以免形成引物二聚体，抑制扩增。如果引物序列可能产生内部二级结构会破坏引物退火稳定性，也要尽量避免。此外，目的序列上并不存在的附加序列，如限制位点和启动子序列，可以加入到引物 5端而不影响特异性。8/8有时候，仅有有限的序列信息可供用于引物设计。比如，如果仅知道氨基酸序列，可以设计简并引物，同时使用较高的引物浓度（1M 到 3M），因为许多简并混合物中的引物不是特异性针对目的模板。为了增加特异性，可以参考密码子使用表，根据不同生物的碱基使用偏好，减少简并性。次黄嘌呤可以同所有的碱基配对，降低引物的退火温度。不要在引物的 3端使用简并碱基，因为 3端最后 3 个碱基的退火足以在错误位点起始 PCR。
