1、解螺旋 陪伴医生科研成长 http:/ 1 DNADNA 甲基化芯片甲基化芯片 -以人肝细胞癌细胞以人肝细胞癌细胞 DNADNA 甲基化谱的检测及分析为例甲基化谱的检测及分析为例 1.1.实验原理实验原理 高通量甲基化芯片Infinium Human Methylation 450K BeadChip能够对人全基因组45万个甲基化位点进行检测，覆盖了上一代 27K 甲基化芯片 90%的位点，并同时增加了 CpG 岛以外的 CpG 位点、人类干细胞非 CpG 甲基化位点、正常组织与肿瘤（多种癌症）组织差异甲基化位点、编码区以外的 CpG 岛、miRNA 启动子区域和已通过 GWAS 的疾病相关区
2、域的位点。2.2.实验目的实验目的 检测人肝细胞癌细胞的 DNA 甲基化谱，明确肝细胞癌细胞中差异甲基化位点和基因的表达分布情况，进一步探讨 DNA 异常甲基化与肝细胞癌发生发展的关系 3.3.实验实验材料材料 3.1.3.1.主要试剂主要试剂 人永生化肝细胞 L02、人 HCC 细胞系 Huh7 均购自中国科学院细胞库；DNA 提取试剂盒（QIAamp DNA Micro Kit）购自美国 QIAGEN 公司；甲基化修饰试剂盒购自沈阳百创特公司；人全基因组甲基化芯片（Infinium Human Methylation 450K Bead Chip）购自美国 Illumina公司。解螺旋 h
3、ttp:/ 核酸蛋白分析仪等。4.4.实验步骤实验步骤 4.1.4.1.DNADNA 提取及甲基化修饰提取及甲基化修饰 用 0.25%含 EDTA 胰酶消化细胞，收集细胞沉淀，取 20L Proteinase K 加入到 1.5 mL 解螺旋 陪伴医生科研成长 http:/ 2 Eppendorf 管内，按 DNA 提取试剂盒说明书中的操作步骤提取 Huh7、L02 细胞 DNA，Nano Drop核酸蛋白分析仪检测DNA提取纯度和浓度，若 OD260 nm/OD280 mn在 1.7-2.0之间则符合实验要求，则样品需要重新提取。将提取的 Huh7、L02 细胞 DNA 按照甲基化修饰试剂盒
4、说明书中的操作步骤进行甲基化修饰。4.2.4.2.芯片杂交、扫描及数据分析芯片杂交、扫描及数据分析 按照 Illumina 公司提供的步骤进行芯片杂交数据扫描使用 manifest 文件，采用Illumina 公司官方提供的 Methylation Module of Genome Studio soft-ware using Methylation v1.9 软件对芯片数据进行分析。-value=intensity of the methylated allele（M）（/intensity of the unmethylated allele+intensity of the methyl
5、ated allele+100代表 CpG 位点的甲基化水平，数值越大，越趋近于 1，甲基化程度越高。解螺旋http:/ empirical ayes oderated检验及 Bonferroni 校正来识别 Huh7 细胞和 L02 细胞之间的差异性甲基化 CpG 位点。初步筛选差异性甲基化 CpG 位点的纳入标准为经过校正的 P 值（Adjust P）0.05，同时表达 差异性分数（|-difference|）0.2，被定义为具有统计学意义。而 Adjust P 0.05和 CpG 覆盖20%，L02 甲基化水平20%，Huh7 甲基化水平25%。5.5.示例示例文献文献1,21,2 1.孙宁,张佳林,张城硕,周翔宇,陈保民.人肝细胞癌细胞 DNA 甲基化谱的检测及分析.中国医科大学学报 2017;4646(12):1111-6.2.Wu DM,Yan YE,Ma LP,Liu HX,Qu W,Ping J.Intrauterine growth retardation-associated syncytin b hypermethylation in maternal rat blood revealed by DNA methylation array analysis.Pediatric research 2017;8282(4):704-11.
