1、21曾冰梅：聚合酶链反应（PCR）分析仪测量结果的不确定度评定I计量检定聚合酶链反应(PCR)分析仪测量结果的不确定度评定曾冰梅（海南科瑞计量技术服务有限公司，海南海口57 0 2 0 6）【摘要】以聚合酶链反应(PCR)分析仪测量结果为研究对象，论述了聚合酶链反应(PCR)分析仪测量结果不确定度的评定方法与过程。【关键词】聚合酶链反应；测量结果；不确定度DOI编码】10.39 6 9/j.issn.1674-4977.2023.06.007Evaluation of Uncertainty inMeasurement Results of PolymeraseChain Reaction1(
2、PCR)AnalyzerZENG Bingmei(Hainan Kerui Measurement Technology Service Co.,Ltd.,Haikou 570206,China)Abstract:Taking the measurement results of polymerase Chain reaction(PCR)analyzer as the research object,this paper discusses theevaluation method and process of uncertainty of measurement results of po
3、lymerase Chain reaction(PCR)analyzer.Key words:polymerase chain reaction;measurement results;uncertainty1概述聚合酶链式反应又称为PCR，是分子生物学技术之一。PCR已成为分子生物学研究必不可少的一部分。PCR技术不仅可用于基础研究，还适用于日常的临床诊断、法医学调查和农业生物技术研究。PCR仪是一种能够为PCR反应自动完成温度循环和孵育的仪器，能够在短时间内将单个DNA分子扩增数百万倍。其扩增过程包括3个连续步骤：1)变性,对双链DNA模板进行加热，使其解离；2)退火，被称为引物的短DNA
4、分子与目标DNA的侧翼区域结合；3)延伸,DNA聚合酶沿着模板链将引物3端进行延伸。将这些步骤重复（循环)2 5 35次，即可按指数方式获得精确的目标DNA拷贝。1.1校准依据JJF15272015聚合酶链反应分析仪校准规范1.2标准器PCR仪温度验证系统，EGFR基因突变标准物质1.3被测对象荧光定量PCR仪。1.4测量方法1.4.1温度示值误差、温度均匀性校准将PCR仪（9 6 孔）及温度校准装置各部件连接完好，在温度传感器表面上涂抹适量的导热油，将温度传感器置于PCR仪（9 6 孔）的加热模块设定孔中。设定温度控制程序见表1。启动温度校准装置，记录整个数据采集过程并保存。表1PCR仪温度
5、控制程序标准程序表步骤设定温度点设定温度持续时间1301 min2953min3302min4903min5503 min6703min7603min8301 min1.4.2升降温速率校准设定PCR仪的温度控制程序，见表2。启动温度校准装22BRAND&STANDARDIZATION品牌与标准化2023年第6 期置，记录整个数据采集过程并保存表2 1PCR仪温度控制程序标准程序步骤设定温度点设定温度持续时间1453min2953min3453 min1.4.3定量PCR仪样本示值误差、样本线性的校准采购相应的PCR反应体系9 6 孔校准板，离心后将校准板置于PCR仪（9 6 孔）的加热模块设
6、定孔中，设定温度控制程序，见表3。设定PCR仪的数据分析参数，计算其线性回归系数r。表3定量PCR仪校准温度控制程序步骤设定温度点设定温度持续时间循环数1502min129510 min139530s454601 min2测量模型2.1温度示值误差校准结果的不确定度评定2.1.1测量模型ATa=T,-T.式中，ATa为温控装置工作区域内温度示值误差，C;T.温控装置工作区域内设定温度值，;T所有测温传感器测量值的平均值,。2.1.2不确定度来源1)测量重复性引人的不确定度分量ui(T)。2)标准温度传感器引人的不确定度分量u2（T）。测量模型中各个输入量的不确定度相互独立，不确定度传播律为：u
7、a=ui(T)+uz(T.)灵敏系数为：C1=1,C2=1。2.1.3不确定度分量的计算1)测量重复性引人的不确定度分量ui（T）Z(T T)ui(T)=n-1在各个温度测量时间段内，读取15个测温探头的数据，见表4。根据测量结果计算得到ui（T）。表4重复性引入不确定度数据序号305060709095130.5550.5760.5070.4590.7495.64230.4850.5260.5470.6291.0395.99330.3750.3160.2970.2890.3495.41430.2850.4060.4570.5090.9495.93530.0650.2060.4170.6591.
8、2596.29630.0450.0660.1970.3190.5895.67729.9750.2160.3170.3590.8095.80829.8650.0960.3270.5291.1196.18929.6449.8460.1070.2590.6595.741029.3050.2360.3470.4990.9395.991129.9250.0360.3470.6691.2796.331229.9549.8960.2170.4891.0096.071329.9150.1660.2070.3190.4896.651429.7650.0360.2470.5190.8896.101529.6749
9、.8860.1570.3590.6495.79SD0.30.20.10.10.30.32）标准温度传感器引人的不确定度分量u2（T）标准温度传感器校准不确定度由标准温度传感器校准证书得到。u2(T.)=Ulk=0.10C/2=0.052.1.4标准不确定度标准不确定度见表5。表5标准不确定度一览表项目ui(T.)/u2(T.)/300.30.05500.20.05600.10.05700.10.05900.30.05950.30.052.1.5合成标准不确定度合成标准不确定度由公式ue=Vui（T）+u（T）计算得出，计算结果见表6。2.1.6扩展不确定度取k-2,PCR仪温度示值误差的扩展不
10、确定度U=kuai,结果见表6。23（编辑：李加鹏）RSD，测量数据及i计算结果见表7计算未知样1和未知样2 的定量结果的相对标准偏差曾冰梅：聚合酶链反应（PCR）分析仪测量结果的不确定度评定|计量检定表6合成标准不确定度和扩展不确定度结果项目合成标准不确定度扩展不确定度包含因子UI300.300.62500.210.52600.110.32700.110.32900.300.62950.300.622.2样本示值误差结果的不确定度评定2.2.1测量模型AC=C.-C,式中，C为样本示值误差，copies/L；C.为仪器测量平均值，copies/L；C.为标准物质标称值，copies/L。2.
11、2.2不确定度来源1)测量重复性引人的不确定度分量u（C）。2）标准物质引人的不确定度分量u2（C.)。2.2.3不确定度分量的计算1)测量重复性引人的不确定度分量u（C）Z(Ci.-C)/(n-1)未知样1:ur(C)=6.6%VZ(C2:-C,)/(n-1)未知样2:urel(C2)=7.6%表7定量重复性引入的不确定度（单位：10 copies/L）项目12345678RSD2.132.081.991.871.761.822.111.98U2.071.762.181.891.961.961.922.116.6%1.891.801.871.911.971.842.131.751.080.9
12、90.941.020.990.941.041.08U20.970.940.971.040.990.951.031.077.6%1.040.981.051.050.901.081.131.262)标准物质引人的不确定度分量u2(C.)由标准物质证书可得：u2(C.)=Ulk=4.56%/2=2.28%,k-2。2.2.4相对标准不确定度相对标准不确定度见表8。表8相对标准不确定度一览表项目um(C.)u2(C.)Ui6.6%2.3%U27.6%2.3%2.2.5合成相对标准不确定度合成相对标准不确定度由urel（C）=u a i（C）+u(C)计算得到，结果见表9。表9合成和扩展不确定度结果合成
13、不确定度扩展不确定度包含因子项目C/(copies/L)um(AC)UI(copies/L)kU1.951056.89%2.7 1042U1.02 1057.93%1.6 10422.2.6扩展不确定度扩展不确定度用公式U,=2um（C）C 计算得到，结果见表9。品【参考文献】1聚合酶链反应分析仪校准规范：JJF15272015S2 测量不确定度评定与表示：JJF1059.12012S.3 张立国，张琚.实时定量PCR技术的介绍 J.生物技术，2003(2):39-40.4黄留玉.PCR最新技术原理、方法及应用 M.北京：化学工业出版社,2 0 0 5:131-139.5 蒋春燕，王泰健，王琴，等.实时荧光定量PCR技术 J.动物医学进展，2 0 0 5(12):9 7-10 1.6】贾月梅.转基因植物检测技术的发展 1.世界农业，2 0 0 7(6):54-56.【作者简介】曾冰梅，女，19 8 9 年出生，工程师，研究方向为温度、压力计量。
