1、ELISAELISA根本原理及在手足口病实根本原理及在手足口病实验室检测中的应用验室检测中的应用 内内 容容 1.ELISA的根本原理 2.ELISA的种类 3.ELISA的组成 4.ELISA结果判定 5.ELISA中的几个重要影响因素 6.ELISA的质量控制 7.ELISA在手足口病致病病毒检测中的应用。1.ELISA的根本原理的根本原理 ELISAEnzyme-linked immunosorbent assay 酶联免疫吸附实验是20世纪60年代开展起来的免疫学检测技术，也是目前应用最广泛的传染病检测方法。ELISA的特点：敏感度和特异度较高，重复性好。试剂比较稳定，易于保存。操作简
2、单，价格廉价，易于在基层大规模使用。易于标准化和对检测对象进行定量。可以自动化。抗原抗体反响抗原抗体反响 抗原或抗体在体外结合到某种固相载体外表后，仍然能保持其免疫学活性而能相互特异性结合。IgG和和IgM抗体的三维结构抗体的三维结构 将抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体后，这种酶标抗原或抗体既能保存与相应抗体或抗原结合的免疫活性，又同时保存酶的活性。由于酶具有很高的催化效率，因此可放大抗原抗体反响效果，从而使测定方法到达很高的敏感性。抗原抗体复合物与酶标的二抗结合，参加适宜的底物在酶的作用下显色，颜色的深浅与特异性抗体水平成比例关系，可进行定性和定量分析。2.ELISA的种类的种类-检测
3、抗原检测抗原 竞争法 ELISA将特异性抗体包被于固相载体外表，洗涤后分为两组，一组参加酶标抗原和被测抗原的混合液，另一组只参加酶标抗原，经孵育洗涤后加底物显色，两组吸光度之差就是所测定未知抗原的量。包被特异性抗体包被特异性抗体 酶标抗原酶标抗原 检测抗原检测抗原 孵育孵育 洗涤后显色洗涤后显色 加样加样 A B 3.显色显色 3.孵育孵育 1.加样加样 检测抗原检测抗原 双抗体夹心法ELISA 将特异性抗体包被于固相载体外表，与标本中相应抗原相结合，洗涤后再参加酶标的第二特异性抗体与抗原结合，参加底物后显色。检测抗原检测抗原 1.加样加样 2.孵育孵育 3.洗涤洗涤 4.加入二抗加入二抗 5
4、.孵育孵育 6.显色显色 酶标特异性抗体酶标特异性抗体 包被特异性抗体包被特异性抗体 检测抗体检测抗体 间接法ELISAIndirect ELISA将特异性抗原包被于固相载体外表，与标本中相应特异性抗体结合，洗涤后再参加酶标的抗人IgG或IgM抗体与之结合，洗涤后参加底物显色。1.加样加样 2.孵育孵育 3.洗涤洗涤 4.加入二抗加入二抗 5.孵育孵育 6.显色显色 检测抗体检测抗体 捕获法ELISACapture ELISA专门用来检测IgM型抗体的方法。将抗人IgM抗体包被于固相载体外表，与标本中所有人IgM抗体结合，洗涤后参加特异性抗原与相应的特异性IgM抗体结合，洗涤后再参加酶标的抗原
5、特异性抗体与之结合，洗涤后参加底物显色。1.加样加样 2.孵育孵育 3.洗涤洗涤 4.加入抗原加入抗原 孵育孵育 5.加入二抗加入二抗 孵育孵育 6.显色显色 检测抗体检测抗体 双抗原夹心法ELISA检测标本中的总抗体包括IgM和IgG型抗体。将特异性抗原包被于固相载体外表，与标本中特异性IgM和IgG型抗体结合，洗涤后参加酶标的特异性抗原与相应的抗体结合，洗涤后参加底物显色。3.洗涤洗涤 1.加样加样 2.孵育孵育 6.显色显色 5.孵育孵育 4.加入酶标加入酶标 抗原抗原 3.ELISA试剂的组成试剂的组成 固相载体：许多物质可以作为固相载体，如纤维素、聚丙烯、聚乙烯、聚氯乙稀和聚苯乙烯等
6、等。目前最为常用的是聚苯乙烯材质的微孔板，多为8 12道96孔板条。酶标记物：酶与抗体的共价结合首先不影响酶及抗体的活性、不产生干扰物质、不产生非特异反响。辣根过氧化物酶HorseRadish Peroxidase，简称HRP是目前应用最为广泛的酶，是从辣根菜的根中提取。碱性磷酸酶Alkaline Phosphatase，简称AP是从小牛肠粘膜中提取。活性高，但提取工艺复杂，价格比较昂贵。底物：不同种类的酶要求使用不同的底物。HRP邻苯二胺Orthopenylenediamine，OPD、四甲基联苯胺Tetramethylbenzidine，TMB和ABTS 2,2-连氮-双-(3-乙基苯并噻
7、唑啉磺酸)，OPD为在ELISA中应用最多的底物，灵敏度高，比色方便，作用后变橙红色，其缺点是配成应用液后稳定性差。TMB经酶作用后由无色变蓝色，目测比照鲜明，加酸停止酶反响后变黄色。AP对硝基苯磷酸酯p-nitrophenylphosphate，p-NPP作为底物。产物为黄色的对硝基酚，在405nm有吸收峰。用NaOH终止酶反响后，黄色可稳定一段时间。洗涤液：聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附作用是普遍性的，因此在ELISA在洗涤时应非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。洗涤是最主要的关键技术，应引起操作者的高度重视，应严格按要求洗涤。洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液，一般是吐温20聚山梨酯。标本
8、稀释液：用来稀释血清标本，有时也稀释酶结合物。RF吸附剂：在进行IgM抗体检测时，间接ELISA方法需要使用RF吸附剂去除类风湿因子的干扰作用。4.结果判断结果判断 S/CO：其中S为Sample(样本)或Specimen(标本)的简写，表示的是标本测定的吸光度值，CO为Cut-off值的简写。除竞争抑制法外，其它ELISA定性测定模式中，当S/CO值大于或等于1时，标本的测定为阳性，小于1时为阴性。S/N或P/N：其中S为Sample(样本)或Specimen(标本)的简写，N为Negative(阴性对照)的简写，P为Patient患者的简写。较早的试剂盒很多都使用S/N或 P/N2.1为阳
9、性判定标准，现仍有一些试剂盒使用这种方式。这种方式与S/CO方式无根本性区别，只不过是前者将阴性对照N的2.1倍视为Cut-off值而已。5.ELISA的几个影响因素的几个影响因素 ELISA本身 方法学上，敏感度和特异性不能到达100%。敏感度增加，那么特异度降低，反之亦然。不同的检测目的对敏感度和特异度的要求不同。如筛查需高敏感的检测试剂，而风疹CRS那么需要高度特异的检测试剂。不同生产商。外部因素 孵育时间和温度。标本的条件。实验对照。实验操作人员的教育背景和培训。试剂保存条件和批号。实验设备。结果解释免疫史、接触史等。结果的抄写和报告。ELISA的影响因素的影响因素-标本标本 采集时间
10、。有无溶血、黄疸。血红蛋白中含有血红素基团，其有类似过氧化物的活性，因此，在以HRP为标记酶的ELISA测定中，如血清标本中血红蛋白浓度较高，那么其就很容易在温育过程中吸附于固相，从而与后面参加的HRP底物反响显色。有无细菌污染。细菌生长所分泌的一些酶可能会对抗原抗体等蛋白产生分解作用；一些细菌的内源性酶如大肠杆菌的-半乳糖苷酶本身会对用相应酶作标记的测定方法产生非特异性干扰。有无反复冻融。机械剪切力将对标本中的蛋白等分子产生破坏作用，从而引起假阴性结果。6.ELISA的质量控制的质量控制 内部质量控制内部质量控制 标准化操作(SOP)仪器设备的维护和校准 数据处理和报告 试剂内部质量控制 外
11、部质量控制外部质量控制 人员培训 职能考核 实验室间复核 现场认证 确保实验室检测结果的准确和可信。容许范围内的容许范围内的 实验室结果实验室结果 人员培训 职能考核 实验室间复核 现场认证 试剂内部 质量控制 数据处理、记录和报告 操作规程 仪器校准、维护 内部质控血清内部质控血清In-house Control,IHC 什么是IHC？在每次ELISA试验时都要参加一个实验室自制的IHC。通过对IHC检测结果的监测，来确保不同时间、不同地点的相同检测结果的正确性和可重复性。为什么不能用试剂本身的对照作为IHC？不能监测标本处理过程。试剂对照本身的局限性，不能用于不同试剂。有些试剂对照不是真血
12、清。质控图举例质控图举例 常规质控图（麻疹）1.461.661.862.062.262.462.662009-7-62009-7-72009-7-212009-7-272009-8-132009-8-242009-8-272009-8-282009-8-312009-9-22009-9-3检测日期S/CO3SD-3SD 2SD-2SD 6.ELISA在手足口病致病病毒检测中的在手足口病致病病毒检测中的应用。应用。商业化试剂检测EV71病毒IgM抗体。贝尔 万泰 捕获法ELISA.仍在评价中。结果要谨慎判断。手足口病的实验室检测手足口病的实验室检测 发病后从疱疹液、脑脊液、咽部、粪便中检测EV-
13、71或CAV-16等肠道病毒特异性核酸阳性。在血液或脑脊液中查到抗EV-71或CAV-16等肠道病毒lgM抗体。急性期与恢复期血清中EV-71或CAV-16等肠道病毒IgG抗体阳转或有4倍增高。急性期与恢复期血清中EV-71或CAV-16等肠道病毒中和抗体阳转或有4倍增高。从疱疹液、脑脊液、咽部、粪便中别离到EV-71或CAV-16等肠道病毒者。捕获法捕获法ELISA测抗体测抗体 IgM捕获法贝尔试剂捕获法贝尔试剂 1.无无IgG或类风湿因子或类风湿因子的干扰的干扰 2.敏感性和特异性高敏感性和特异性高 EV-71病毒病毒IgM抗体检测抗体检测-贝尔贝尔 试剂室温平衡30min以上。配液：将浓
14、缩洗涤液用蒸馏水或去离子水20倍稀释。编号：将标本对应微孔板按序编号，每板应设阴性对照3孔，阳性对照1孔和空白对照1孔。加稀释液：每孔参加标本稀释液100l，空白孔和阴性、阳性对照孔除外。加样：分别在相应孔中参加阴性、阳性对照100l，待测标本10l，轻轻振荡混匀。孵育：用封板膜封板后，37孵育50min。洗板：小心揭掉封板膜，用洗板机洗涤5遍，最后一次扣干。加酶标工作液：每孔参加100l，空白孔除外。孵育：用封板膜封板后，37孵育50min。洗板：操作同上。显色：每孔参加显色剂A、B液各50l，轻轻振荡混匀，37避光显色15min。测定：每孔参加终止液50l，轻轻振荡混匀，10min内测定结果。设定酶标仪波长于450nm，用空白孔调零后测定各孔A值。试剂对照范围 阴性对照A值0.1。假设1孔阴性对照A值0.1应舍弃，假设2孔或3孔阴性对照A值0.1，应重复试验。阳性对照A值0.3。结果判断 临界值Cutoff计算：临界值=0.1+阴性对照A均值。阴性对照孔A值低于0.05按0.05计算。阴性判定：标本A值临界值，为EV-71病毒IgM抗体阴性。阳性判定：标本A值临界值，为EV-71病毒IgM抗体阳性。THANKS
