1、课题课题2 2 土壤中分解尿素的细菌的土壤中分解尿素的细菌的别离与计数别离与计数 专题专题2 2 微生物的培养与应用微生物的培养与应用 一、课题背景一、课题背景 1 1、尿素的利用、尿素的利用 尿素尿素是一种重要的是一种重要的农业氮肥。农业氮肥。尿素尿素不能直接不能直接被农被农作物作物吸收。吸收。土壤中的细菌将尿素土壤中的细菌将尿素分解成氨分解成氨之后才之后才能被植物利用。能被植物利用。2 2、细菌利用尿素的原因、细菌利用尿素的原因 土壤中的细菌分解尿素是因为它们土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶能合成脲酶 CO(NHCO(NH2 2)2 脲酶脲酶 +H+H2 2OO COCO2 2 +
2、2+2NHNH3 3 3 3、常见的分解尿素的微生物、常见的分解尿素的微生物 芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。也能分解尿素。4 4、课题目的、课题目的 从土壤中别离出能够分解尿素的细菌从土壤中别离出能够分解尿素的细菌 统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌 一一.研究思路研究思路.筛选菌株筛选菌株.统计菌落数目统计菌落数目.设置对照设置对照 1 1、实例：、实例：启示：启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的寻找
3、目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。要求，到相应的环境中去寻找。原因：原因：因为热泉温度因为热泉温度707080800 0C C，淘汰了绝大，淘汰了绝大多数微生物只有多数微生物只有TaqTaq细菌被筛选出来。细菌被筛选出来。DNADNA多聚酶链式反响是多聚酶链式反响是一种在体外将少量一种在体外将少量DNADNA大量复制的技术，此项大量复制的技术，此项技术要求使用耐高温技术要求使用耐高温930C930C的的DNADNA聚合酶聚合酶。要别离一种微生物，必须根据该微生物的特点，要别离一种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等；包括营养、生理、生长条件等；方法
4、：方法：抑制大多数微生物不能生长抑制大多数微生物不能生长 造成有利于该菌生长的环境，造成有利于该菌生长的环境，结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过平板稀释等方法对它进行纯化培养别离。平板稀释等方法对它进行纯化培养别离。2、实验室中微生物的筛选原理：、实验室中微生物的筛选原理：人为提供有利于人为提供有利于目的菌株目的菌株生长的条件生长的条件(包括营包括营养、温度、养、温度、pH等等)，同时抑制或阻止其他微生，同时抑制或阻止其他微生物生长。物生长。15.0g15.0g 琼脂琼脂 1.0g1.0g 尿素尿素 10.0g10.0g 葡萄糖葡萄糖 0.2g
5、0.2g MgSOMgSO447H7H2 2O O 2.1g2.1g NaHNaH2 2POPO4 4 1.4g1.4g KHKH2 2POPO4 4 3 3、土壤中分解尿素的细菌的别离与计数所需培、土壤中分解尿素的细菌的别离与计数所需培养基：养基：从物理性质看此培养基属于哪类？从物理性质看此培养基属于哪类？固体培养基固体培养基 在此培养基中哪些作为碳源、氮源？在此培养基中哪些作为碳源、氮源？碳源：碳源：葡萄糖、尿素葡萄糖、尿素 氮源：氮源：尿素尿素 培养基的培养基的氮源为尿素氮源为尿素，只有能合成，只有能合成脲酶脲酶的微生物的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。才能分解尿素，以尿素作为氮源。
6、缺乏缺乏脲酶的微脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。择出分解尿素的微生物。5 5、培养基选择分解尿素的微生物的原理、培养基选择分解尿素的微生物的原理 1 1、显微镜直接计数：、显微镜直接计数：利用利用血球计数板血球计数板，在显微镜下计算一定容积里，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。样品中微生物的数量。.统计菌落数目：统计菌落数目：不能区分死菌与活菌；不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；不适于对运动细菌的计数；需要相对
7、高的细菌浓度；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；个体小的细菌在显微镜下难以观察；缺点缺点 2.2.间接计数法活菌计数法间接计数法活菌计数法 原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。常用方法：稀释涂布平板法。常用方法：稀释涂布平板法。每克样品中的菌落数每克样品中的菌落数(C(CV)V)M M 其中，其中，C C代表某一稀释度下平板上生长的平代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，均菌
8、落数，V V代表涂布平板时所用的稀释液代表涂布平板时所用的稀释液的体积的体积(ml)(ml)，M M代表稀释倍数。代表稀释倍数。本卷须知本卷须知 为了保证结果准确，一般选择菌落为了保证结果准确，一般选择菌落数在数在3030300300的平板上进行计数。的平板上进行计数。为使结果接近真实值可将同一稀释为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中，经度加到三个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出菌落平均数。涂布，培养计算出菌落平均数。统计的菌落往往比活菌的实际数目统计的菌落往往比活菌的实际数目低。低。涂布平板法所选择的稀释度很重要，涂布平板法所选择的稀释度很重要，一般以三个稀释度中
9、的第二个稀释度一般以三个稀释度中的第二个稀释度所出现的平均菌落数在所出现的平均菌落数在5050个左右为最个左右为最好。好。设置对照的主要目的设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。.设置对照：设置对照：实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，目的实验时，A A同学从对应的同学从对应的10106 6倍稀释的培养基倍稀释的培养基中筛选出大约中筛选出大约150150个菌落，但是其他同学在同样个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约的
10、稀释度下只选择出大约5050个菌落。分析其原因。个菌落。分析其原因。原因：原因：土样不同土样不同，培养基污染或操作失培养基污染或操作失误误 (3)混入了其他的含氮物质混入了其他的含氮物质 小结：小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。说服力，对照的设置是必不可少的。方案一：方案一：由其他同学用与由其他同学用与A同学同学相同土样相同土样进行实验进行实验 方案二：方案二：将将A同学配制的培养基在同学配制的培养基在不加土样不加土样的情的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。否
11、受到污染。结果预测：如果结果与结果预测：如果结果与A同学一致，那么证明同学一致，那么证明A无无误；如果结果不同，那么证明误；如果结果不同，那么证明A同学存在操作失误同学存在操作失误或培养基的配制有问题。或培养基的配制有问题。二二.实验的具体操作实验的具体操作 .土壤取样土壤取样 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土土3cm3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。信封中。取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。前都要灭菌。.制备培养基：制备培养基：制备以尿素为唯一氮
12、源的制备以尿素为唯一氮源的选择培养基选择培养基。应在火焰旁称取土壤应在火焰旁称取土壤10g10g。在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行 别离不同的微生物采用不同的稀释度别离不同的微生物采用不同的稀释度 原因：不同微生物在土壤中含量不同原因：不同微生物在土壤中含量不同 目的：保证获得菌落数在目的：保证获得菌落数在3030300300之间、适于之间、适于计数的平板计数的平板 三三样品的稀释样品的稀释 为什么别离不同的微生物要采用不同的稀释度为什么别离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素测定土壤中细菌的总量
13、和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗选用的稀释范围相同吗？原因：土壤中各类微生物的数量原因：土壤中各类微生物的数量单位：单位：株株/kg是不同的是不同的。例如在干旱土壤中的上例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2 185万万，放线菌数约为放线菌数约为477万万，霉菌数约为霉菌数约为23.1万万。结论：为获得不同类型的微生物结论：为获得不同类型的微生物，就需要就需要按不同的稀释度进行别离按不同的稀释度进行别离，同时还应当有同时还应当有针对性地提供选择培养的条件针对性地提供选择培养的条件。.取样涂布取样涂布 实验时
14、要实验时要对培养皿作对培养皿作好标记。注好标记。注明培养基类明培养基类型、培养时型、培养时间、稀释度、间、稀释度、培养物等。培养物等。如果得到了如果得到了2个或个或2个以上菌落数目在个以上菌落数目在30300的平的平板，那么说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计板，那么说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，说明试验不精确，需要重新实验。说明试验不精确，需要重新实验。.微生物的培养与观察微生物的培养与观察 在菌落计数时，每隔在菌落计数时，每隔24h24h统计一次菌落数目。统计一次菌落数目。选取菌落
15、数目稳定时的记录作为结果，以防止选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间缺乏而导致遗漏菌落的数目。因培养时间缺乏而导致遗漏菌落的数目。培养不同微生物往往需要不同培养温度。培养不同微生物往往需要不同培养温度。细菌：细菌：30303737培养培养1 12d2d 放线菌：放线菌：25252828培养培养5 57d7d 霉菌：霉菌：25252828的温度下培养的温度下培养3 34d4d。微生物的培养与观察微生物的培养与观察 三三.结果分析与评价结果分析与评价 1.1.通过对照实验，假设培养物有杂通过对照实验，假设培养物有杂菌污染，菌落数偏高；假设培养物菌污染，菌落数偏高；假设培养物混入其他氮
16、源，那么菌落形态多样，混入其他氮源，那么菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出分解尿素的菌落数偏高，难以选择出分解尿素的微生物。微生物。2.2.提示：选择每个平板上长有提示：选择每个平板上长有3030300300个菌落的稀释倍计算每克样品的个菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最适宜。同一稀释倍数的三个重菌数最适宜。同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相差悬殊，如相差较复的菌落数不能相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。大，表示实验不精确。四、操作提示四、操作提示 无菌操作无菌操作 做好标记做好标记 规划时间规划时间 五五.课外延伸课外延伸 在以尿素为唯一氮源的培养基中在以尿素为唯一氮源的培养基中参加酚红指示剂。培养某种细菌后，参加酚红指示剂。培养某种细菌后，如果如果PHPH升高，指示剂将变红，说明升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。该细菌能够分解尿素。测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到 伊红美蓝伊红美蓝 培养培养基上培养，大肠杆菌基上培养，大肠杆菌菌落呈现黑色菌落呈现黑色，
