1、东南大学学报（医学版）（），；（）：收稿日期 修回日期 基金项目 河南省医学科技攻关计划（联合共建）项目（）作者简介 张永红（），女，河南漯河人，主治医师，医学硕士。：引文格式 张永红，李存涛，高明敏，等 二甲双胍通过 信号通路抑制皮肤瘢痕疙瘩成纤维细胞的上皮间质转化 东南大学学报（医学版），（）：论著 二甲双胍通过 信号通路抑制皮肤瘢痕疙瘩成纤维细胞的上皮间质转化张永红，李存涛，高明敏，张玉红（郑州大学附属郑州中心医院 皮肤科，河南 郑州）摘要 目的：探讨二甲双胍（）抑制低氧诱导的瘢痕疙瘩成纤维细胞（）上皮间质转化（）的作用机制。方法：被分为低氧组和对照组，低氧组细胞在低氧环境下培养 以诱导
2、，对照组细胞常规培养。用 或其溶剂生理盐水（生理盐水组）低氧诱导；在 和低氧条件下用纤维母细胞生长因子受体（）过表达载体（）或空载体（）处理，或者在 和低氧条件下用重组人巨噬细胞刺激 蛋白（）处理；低氧条件下的 分为生理盐水组、组、组、组、组。采用细胞计数试剂盒（）评估细胞增殖活力，迁移小室实验测量细胞迁移，蛋白免疫印迹法评估、钙黏蛋白、波形蛋白和 的表达水平。结果：低氧组 的细胞增殖活力、迁移率及 较对照组明显增加。组的、表达以及低氧诱导的细胞增殖活力、迁移率及 标志物的表达量都较生理盐水组明显降低（）。与 组及 组比较，组中、表达以及低氧诱导的细胞增殖活力、迁移率和 标志物均明显增高（）。
3、与 组相比，组 表达及低氧诱导的细胞增殖活力、迁移率、标志物的 表达量均明显增高（.）。结论：通过抑制 信号通路来消除 中低氧诱导的。关键词 二甲双胍；上皮间质转化；纤维母细胞生长因子受体；巨噬细胞刺激；瘢痕疙瘩中图分类号 文献标志码 文章编号（）：，（，）：（）（）（）：，（）（）（），（），（），：，（），（），（）：；瘢痕疙瘩是一种引起人体不适、机体功能受限以及心理障碍的皮肤疾病，瘢痕疙瘩内部常表现出缺血低氧特征。目前已证明上皮间质转化（，）是参与瘢痕疙瘩形成和发展的关键细胞学改变。二甲双胍（，）是一种可以抑制肿瘤和糖尿病中 的关键药物；在体外也可抑制瘢痕疙瘩形成。然而 诱导抑制瘢痕疙瘩
4、的完整机制仍然未知，因此本研究观察 对瘢痕疙瘩成纤维细胞（，）的作用并探讨其机制。材料与方法 临床样本瘢痕疙瘩标本及邻近正常皮肤组织采集于我院皮肤科。例瘢痕疙瘩患者均为黄种女性，年龄分别为、岁，瘢痕疙瘩位置均在耳垂。本研究中执行的所有程序均经我院医学伦理委员会批准，所有受试者均签署知情同意书。的方法：在低氧培养箱中培养 以诱导，分为对照组和低氧组。用 或其溶剂生理盐水（生理盐水组）低氧诱导：在 和低氧条件下用纤维母细胞生长因子受体（，）过 表 达 载 体（，）或空载体（，）处理 或者在 和低氧条件下用重组人（，）巨噬细胞刺激（，）蛋白（）处理。试剂与耗材（）购于美国 公司。杜氏改良培养基（）和
5、胎牛血清（）购于美国 公司。购于美国派普泰克公司。和空载体（，）购于上海 公司。试剂购于美国 公司。细胞计数试剂盒（）、反应混合物逆转录 试剂盒、试剂盒、试剂盒购于上海碧云天公司。蛋白酶抑制剂的 缓冲液、聚偏二氟乙烯膜购于美国 公司。抗人、钙黏蛋白、抗人波形蛋白、抗人 一抗购于美国 公司。细胞培养原代人 根据文献报道进行分离。手术切除人瘢痕疙瘩组织的表皮和脂肪组织，只保留纤维组织的真皮层，随后切成小块。组织小块在包含 倍胶原酶裂解缓冲液的 中消化，下 离心 后，收集沉淀物并在补充有 的青霉素 链霉素和 胎牛血清的（、）中培养。细胞活力检测 实验用于测量细胞活力。将（每孔 个）接种到 孔板中。分
6、别在常氧下（设为对照组）和低氧培养箱（、）中东南大学学报（医学版）年 月，（）培养，低氧培养箱中细胞再分为生理盐水组和 组两组。对照组细胞培养 ，低氧培养的两组分别加生理盐水 或 处理细胞 后，每孔加入 ，孵育 。使用酶标仪在 处测量 组的吸光度值。低氧培养条件下 细胞的处理与分组根据制造商提供的说明，使用 试剂将 的 或 的 转入 细胞。将转染的细胞培养 ，并收集用于实时定量（，）和蛋白免疫印迹分析。根据是否使用 治疗、联合使用 过表达，或联合使用 处理，将 在低氧条件下进行实验观察。在低氧条件下培养 ，分为 组、生理盐水组、联合 过表达载体转染（）组、联合空载体（）（）组、联合、组。在 下
7、以 的浓度储存。低氧培养环境下，组用 处理细胞；生理盐水组用等体积的生理盐水处理细胞；组在转染 的同时用 处理细胞 ；组 在 转 染 的 同 时 用 处理细胞 ，组用 和 处理细胞 。用 试剂盒提取 组和 组 的总。根据制造商提供的说明，使用 反应混合物逆转录。随后的定量 在 系统中使用 试剂进行。具体引物如下：正向 ，反 向；：正向，反向；钙黏蛋白：正向，反向；波形蛋白：正向，反 向；肌动蛋白：正向，反向。根据制造商的协议，在总体积 的反应混合物中进行，并按以下步骤进行扩增：，然后 和 循环 次。生物学重复为。方法用于计算，其中 目标基因 肌动蛋白，测定值 校正值。蛋白免疫印迹实验离心收集
8、组、生理盐水组、组、组、组的，并用磷酸盐缓冲液洗涤。细胞在含有蛋白酶抑制剂的 缓冲液中裂解。裂解物通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，随后经电印迹转移到聚偏二氟乙烯膜上。在用 脱脂牛奶封闭后，将膜与一抗在 下孵育过夜。一抗包括抗人、钙黏蛋白、抗人波形蛋白、抗人 和 肌动蛋白。然后将印迹与二抗在室温下孵育 。每个实验重复 次。使用 系统（）和 （富士胶片）将目标蛋白条带显色。用 软件进行定量分析。迁移小室法检测细胞的迁移收集对照 组、生理盐水组、组、组、组细胞，调整细胞为个，加入到的 小室的上室。温育 后，使用细胞用无菌棉签小心除去膜上表面的细胞。最后将已经穿透侵入膜下表面的细胞用甲醇固定
9、，用的 染色溶液染色，并在显微镜下进行细胞计数。统计学处理采用 统计软件进行统计学处理。计量数据以均值 标准差表示，正态分布且方差齐性的数据采用单因素方差分析，组间两两比较采用 检验；方差不齐的数据采用 检验。.为差异具有统计学意义。非正态分布的数据采用非参数检验。结 果 二甲双胍抑制低氧诱导下 的增殖活性检测 对低氧环境中 增殖活力的影响，结果（图）显示，低氧诱导下 的增殖率明显高于对照组（）。而低氧下加入 的 处理 后，与生理盐水组相比，组 的增殖率明显降低（）。抑制低氧诱导下 的迁移进一步评估 对低氧环境中 迁移能力的影响，结果如图 所示，低氧下加入 的 处理 后，与生理盐水组比较，组
10、的迁移数目明显减少（）。张永红，等 二甲双胍通过 信号通路抑制皮肤瘢痕疙瘩成纤维细胞的上皮间质转化 与对照组比，；与生理盐水组比，图 抑制低氧诱导的 增殖 调控 中 标志物和 信号蛋白的表达 通过蛋白免疫印迹法分析 对、和 标志物、钙黏蛋白、波形蛋白的表达，结果如图。与生理盐水组比，组中、波形蛋白的表达量明显降低，而 钙黏蛋白的表达明显增加（）。促进 中 的表达并诱导 细胞转染 或。与 组比较，组 的 和蛋白水平都增加（均 ），并且 的表达显著增加（均 ）。组迁移细胞数和 标志物、波形蛋白的表达量均明显增高，且 钙黏蛋白的表达明显降低（均 ）。见图。与生理盐水组比较，图 抑制低氧诱导下 的迁移
11、 生理盐水组细胞迁移检测结果（染色 ）；组细胞迁移检测结果（染色）；孵育 后迁移细胞的数量 通过抑制 通路抑制 的 进一步研究 影响瘢痕疙瘩 调控的机制，结果显示：与 组比，组中细胞的迁移细胞数和 标志物、波形蛋白的 表达量均明显增高，且 钙黏蛋白明显降低（均 ）；而与 组比，组中迁移细胞数以及 标志物、波形蛋白的 表达量都明显增高，且 钙黏蛋白明显降低（均 ）。见图。这表明 可以抑制，且其机制是通过抑制 通路抑制 的。讨 论 是瘢痕疙瘩进展的主要诱导细胞。越来越多的研究认为 的 是诱导瘢痕疙瘩进展的关键因素，因此我们以 为研究对象，着重探讨 在经 处理后细胞增殖、迁移、标志物的表达变化。根据
12、本研究结果，我们发现：（）低氧诱导下 的增殖能力增加、迁移细胞数目增多，并且 标志物的表达明显上调；（）抑制 中的 信号通路是 抑制 增殖能力、迁移和 标志物表达的关键机制。本研究显示 可通过降低 和 来逆转，表明 参与 信号通路的失活以抑制瘢痕疙瘩的发展。大量研究表明，在促进上皮细胞的 和细胞迁移中起着关键作用。通过 促进细胞纤维化。瘢痕疙瘩主要发生在外伤后，皮东南大学学报（医学版）年 月，（）与生理盐水组比较，图 调控 中 标志物和 信号蛋白的表达 蛋白免疫印迹结果；各个蛋白相对表达水平 与 组比较，图 抑制 中 表达并诱导 法检测 过表达后的 水平；蛋白免疫印迹结果；各个蛋白相对表达水平
13、张永红，等 二甲双胍通过 信号通路抑制皮肤瘢痕疙瘩成纤维细胞的上皮间质转化 与 组比较，；与 组比较，图 通过抑制 通路抑制 的 细胞迁移检测结果（染色）和孵育 后迁移细胞的数量；法检测 标志物、波形蛋白和 钙黏蛋白的 水平肤血管网络被破坏，导致局部组织的低氧环境。此外，组织损伤引起的炎症和修复过程中的高代谢状态会显著增加耗氧量并加剧低氧。因为低氧微环境下，瘢痕疙瘩中的 往往上调，而且配体 信号明显促进心肌细胞的 和迁移能力。我们的研究结果证明，过表达可以明显促进 的 和迁移能力，而 可以通过抑制 表达阻碍 的 和迁移。是哺乳动物肿瘤抑制通路的核心激酶，新发现的证据亦支持 在许多人类疾病如肝脏
14、和肠道再生、先天免疫疾病中发挥微妙而复杂的作用。有研究表明 可调控细胞。本研究也观察到，人重组 蛋白能抑制 的迁移和 标志物、波形蛋白的表达，并促进 钙黏蛋白的表达。多项研究表明，是 特异性底物，而且 是 相关信号通路的关键下游效应因子。本研究在 中过表达了，同样观察到 的蛋白表达被 显著上调。不仅如此，低东南大学学报（医学版）年 月，（）氧诱导下，在 表达增高的同时，表达也增高。本研究中我们观察到 信号轴对低氧诱导下 的 至关重要，因为过表达 不仅促进了 的表达，同时逆转了 对低氧条件下 的抑制作用，而人重组 蛋白明显促进 的迁移和 标志物的表达。我们的研究结果表明 信号参与了瘢痕疙瘩的。已
15、被证实还可以发挥抗瘢痕疙瘩的作用。本研究同样观察到 对 增殖和迁移的抑制作用，而且 可以通过抑制 信号通路逆转 中低氧诱导的。综上所述，本研究表明，低氧环境通过激活 诱导的 促进了 的迁移，通过 信号通路抑制 中低氧诱导的。基于上述研究数据，我们提出 通路参与低氧诱导的瘢痕疙瘩，因此 可能是治疗瘢痕疙瘩的潜在药物，而且 信号通路是一种潜在的瘢痕疙瘩治疗靶点。参考文献 ，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（），（）：，（）：，（）：，（）（），（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：张永红，等 二甲双胍通过 信号通路抑制皮肤瘢痕疙瘩成纤维细胞的上皮间质转化
