1、西 北 农 业 学 报 2 0 2 3,3 2(3):4 1 1-4 1 9A c t aA g r i c u l t u r a eB o r e a l i-o c c i d e n t a l i sS i n i c ad o i:1 0.7 6 0 6/j.i s s n.1 0 0 4-1 3 8 9.2 0 2 3.0 3.0 0 9h t t p s:/d o i.o r g/1 0.7 6 0 6/j.i s s n.1 0 0 4-1 3 8 9.2 0 2 3.0 3.0 0 9复合纳米抗菌肽防治羊皮下脓肿病的效果收稿日期:2 0 2 1-1 0-0 9 修回日期:2
2、 0 2 1-1 0-2 7基金项目:陕西省重点研发计划项目(2 0 1 9 NY-0 7 9)。第一作者:王 平,女,硕士研究生,从事羊临床疾病防治研究。E-m a i l:2 2 4 9 6 4 5 4 0 2q q.c o m通信作者:华 松,男,教授,主要从事动物胚胎工程与临床疾病研究。E-m a i l:h s 8 6 3n w s u a f.e d u.c n王 平1,韩晓芳1,郭子记2,李锦旗3,张 利4,赵 鹏4,张宇豪1,华 松1(1.西北农林科技大学 动物医学院,陕西杨凌 7 1 2 1 0 0;2.榆林市榆阳区畜牧技术推广站,陕西榆林 7 1 9 0 0 0;3.榆林市
3、榆阳区畜牧兽医局,陕西榆林 7 1 9 0 0 0;4.榆林市府谷县动物疫病预防控制中心,陕西榆林 7 1 9 4 0 0)摘 要 抗菌肽具有抗菌谱广、不易产生耐药性、无残留等优点,而金黄色葡萄球菌是羊和兔皮下脓肿病的主要病原菌之一。通过对羊皮下脓肿组织样本分离到的金黄色葡萄球菌进行体外抗菌肽抑菌活性检测,同时建立试验兔金黄色葡萄球菌皮下脓肿模型,使用抗菌肽进行防治,最后在羊场开展抗菌肽防治羊皮下脓肿病的试验。结果发现抗菌肽对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为39 0 0g/m L,抑菌圈直径达到4 0mm,抗菌效价U=1.31 07。试验兔防治试验发现,预防组:预防性饲喂抗菌肽能避免金黄色葡萄球
4、菌皮下脓肿病的发生;治疗组:饲喂抗菌肽可使致病后的试验兔1 4d内康复。抗菌肽防治羊皮下脓肿病发现,预防试验:预防组发病率为0.6%(n=8 3 4),而对照组发病率为1 2.4%(n=7 8 0);治疗试验:发病后采用抗菌肽结合简单外科手术治疗,1 4d内治愈率达9 5.5%(n=1 1 0),3个月内复发率为0,而未用抗菌肽,仅采用简单外科手术治疗,1 4d内治愈率为3 6.4%(n=1 1 0),3个月内复发率为7 7.3%(n=1 1 0)。说明抗菌肽具有较好的防治羊皮下脓肿病的效果。关键词 皮下脓肿病;抗菌肽;金黄色葡萄球菌;羊;兔 羊皮下脓肿病传染性强,发病率高,病程长,传播范围广
5、,各个品系的绵羊、山羊都易感染,患羊的皮下脓肿形成后会持续增大,临床表现为面部、颈部、胸腹部和尻部等淋巴结部位肿大,因此,常规抗菌药物对该病治疗效果不佳,且容易产生耐药性。不仅造成饲料浪费,增加养殖成本,而且威胁到公共卫生健康,带来的经济损失不可小觑。羊皮下脓肿病例在全国各地均有报道,大多数养殖场的绵羊和山羊脓肿病发病率为2%7%,部分养殖场可达2 0%以上。近年来,由于各地大力发展畜牧业,全国各地羊流动频繁,该病的发病率有逐渐提高的趋势。发病以1岁左右的羊居多,发病率随年龄的增大而升高,该病无明显的季节性规律,但以夏秋季为主1。环境致病菌的持续存在和羊群皮肤的机械性损伤是导致羊皮下脓肿病的主
6、要诱因。经过农业农村部动物生物技术重点实验室对甘肃、陕西两省几十家养殖场进行羊皮下脓肿病的分离、纯化,发现致病菌主要为伪结核棒状杆菌和金黄色葡萄球菌两种。此外,金黄色葡萄球菌还是肉兔养殖中常见的病原菌,感染兔后引起局部脓肿及其他炎症,症状同羊相似。目前,金黄色葡萄球菌是极易产生耐药性的皮下脓肿病病原菌,几乎可以对所有的抗生素产生耐药性2。随着抗生素残留以及病原菌耐药现象的加剧,抗菌药物无论在新药物研发还是避免耐药性的研究中均遇到了瓶颈3。抗菌肽被称为天然的抗生素,具有抗菌谱广、无残留,不易产生耐药性,并且能够调节胃肠道菌群,改善机体的免疫力,保护机体免遭病原菌侵害。目前抗菌肽用作饲料添加剂,预
7、防疾病,改善肠道菌群以及增强免疫力等方面已经取得较好效果。本试验所用的复合纳米抗菌肽,其抗菌活性强于单一的成份4,并且利用医药级的纳米材料进行包被,使其具有耐高温、耐强酸、易溶于水等优势5,已被证明对金黄色葡萄球菌、致病性大肠杆菌、链球菌、巴氏杆菌、梭菌和李氏杆菌等常见致病菌有强烈的抑制和杀灭作用。鉴于目前尚未有抗菌肽对羊皮下脓肿病的动物试验和应用研究方面的报道,本研究通过对羊皮下脓肿病组织样本分离到的金黄色葡萄球菌进行抗菌肽体外抑菌活性测试,同时开展试验兔及羊皮下脓肿病的防治试验,以期为抗菌肽替代抗生素用于防治动物皮下脓肿病提供实践依据。1 材料与方法1.1 试验材料试验菌株是从湖羊皮下脓肿
8、病组织样本中分离、纯化所得,经过基因测序确定为金黄色葡萄球菌;营养琼脂(N B)、MH培养基购自北京奥博星生物技术有限公司;复合纳米抗菌肽(由农业农村部动物生物技术重点实验室赠送);试验动物成年健康雌性家兔及全价兔粮购自西安交大实验动物中心。1.2 常用抗生素对金黄色葡萄球菌的药物敏感性试验将高压灭菌好的MH琼脂培养基无菌操作分装到直径为9 0mm的无菌培养皿中,每个培养皿平均分装1 52 0m L,使用棉签蘸取0.5麦氏比浊的菌,在培养皿中分3次密集划线,使菌落均匀分布于培养基表面;用镊子取药敏片,置于培养基上。将培养皿置于3 7恒温箱中培养2 4h后测量抑菌圈直径。每种药品做3个平行,试验
9、重复3次。培养2 4h后,每个抑菌圈测量3次,取平均值,结果判定依据药敏试验执行标准C L S I(2 0 1 5版)。1.3 抗菌肽对金黄色葡萄球菌的体外抑菌试验1.3.1 微量稀释法最小抑菌浓度测定 称取1.0g抗菌肽溶于2m L蒸馏水中并混匀,以转速1 20 0 0r/m i n离心5m i n,取上清液,备用。配制0.5麦氏比浊度菌液,取出一块新的无菌的9 6孔板,从第1至第1 0孔分别加入5 0L的MH液体培养基;之后在第一孔中加入5 0L抗菌肽,轻轻混匀后,从第一孔吸取5 0L加入第二孔中,依次类推,到第十孔混匀后吸取5 0L弃掉;最后在第1至第1 0孔分别加入5 0L菌液,稀释后
10、的质量浓度 依 次 呈 现1 0个 梯 度(1 2 50 0 0g/m L、6 25 0 0g/m L、3 12 5 0g/m L、1 56 2 5g/m L、78 1 2g/m L、39 0 6g/m L、19 5 3g/m L、9 7 6g/m L、4 8 8g/m L、2 4 4g/m L),最 后 置 于3 7恒温箱中培养2 4h,观察生长情况。1.3.2 琼脂扩散抑菌圈法细菌活化 挑取单菌落于液体B H I培养基中,2 2 0r/m i n震荡 培养4h;稀释菌液:取培养的菌液用生理盐水稀释至0.5麦氏比浊浓度;1/2营养琼脂培养基配制:按1 8.0g/L的比例称取营养肉汤粉培养基,
11、高压灭菌后取出,备用,待培养基冷却至4 0 时加入1m L菌液(1.51 08C F U/m L),随后立即倒入培养皿 中 冷 却 凝 固,备 用。使 用 牛 津 杯(内 径6mm,外经8mm,高1 0mm)在刚刚冷却的培养基中间打孔;加药:吸取抗菌肽原液5 0L滴于打好的孔中,设置3个平行,置于恒温箱中培养,每隔4h测量抑菌圈直径,并利用药物敏感性较好的红霉素药敏片进行对照。测量后对同一抑菌圈直径取平均值,结果以“平均数标准差”表示,用S P S S1 8.0软件进行两独立样本的t检验。1.4 家兔致病模型的构建及防治试验1.4.1 动物饲养 所有试验兔饲喂在同一条件下(温度1 8,湿度3
12、0%,环境干净、舒适、通风良好),抗菌肽饲喂量参照本品在牛羊猪上的推荐量(5 0g抗菌肽兑10 0 0k g饲料),每只试验兔每日饲喂饲料1 8 0g,自由饮水。1.4.2 试验设计 按照表1将所有试验兔分组,分别设置预防组、治疗组、阳性对照组及健康对照组。(1)预防组:抗菌肽饲喂,将抗菌肽溶于无菌水中,按照每日饲料比重0.0 0 5%的量,使用1m L无针头注射管灌服。提前1周开始每日灌服1次;攻毒:参照江炜等6对每只试验兔后颈部皮下注射21 09C F U/m L1m L的菌,且使用对数期菌株来保证细菌活性;测量皮下脓肿:从攻毒第2天起,每隔2d对每只试验兔进行脓肿测量(纵向直径的长度),
13、同时观察试验兔的精神状态。(2)治疗组:攻毒(同上);抗菌肽饲喂:攻毒后第2天时开始灌服饲喂抗菌肽,比例为每日饲料比重的0.0 1%;测量皮下脓肿;病理切片制作与观察:采集化脓灶周围皮肤组织以及发生明显病变的实质性脏器组织制作组织切片,使用正置显微镜进行切片观察,照片拍摄使用M o t-i c I m a g e sp l u s2.0软件。(3)阳性对照组:攻毒(同上);测量皮下脓肿。(4)健康对照组:后颈部注射生理盐水,且正常饲喂兔粮。214西 北 农 业 学 报3 2卷表1 金黄色葡萄球菌试验兔分组T a b l e1 R a b b i t g r o u p i n gf o rS.
14、a u r e u st e s t组别G r o u p提前7d饲喂抗菌肽F e e da n t i m i c r o b i a l p e p t i d e s7d a y s i na d v a n c e攻毒C h a l l e n g e致病后开始或继续饲喂抗菌肽S t a r to rc o n t i n u e f e e d i n go f a n t i m i c r o b i a l p e p t i d e sa f t e r i l l n e s s数量N u m b e r预防组P r e v e n t i o ng r o u p+3 2
15、治疗组T r e a t m e n tg r o u p-+3 2阳性对照组P o s i t i v ec o n t r o l g r o u p-+-3 2健康对照组H e a l t h yc o n t r o l g r o u p-1 2注:“+”代表执行该项操作;“-”代表不执行该项操作。N o t e:“+”r e p r e s e n t sp e r f o r m i n gt h i so p e r a t i o n;“-”m e a n s t h eo p e r a t i o nn o tp e r f o r m e d.1.5 抗菌肽防治羊皮下脓
16、肿病试验试验地点位于甘肃省与陕西省部分湖羊养殖场,防治试验包括6个羊场和6个合作社,共计1 2个养殖单元,16 1 4只湖羊,预防试验和治疗试验各6个养殖单元,每个试验平均分成试验组与对照组。(1)预防试验:经过两名兽医的全身肉眼观察,结合触摸检查,确定无皮下脓肿的羊,羊只月龄大小不限,5 0g纳米抗菌肽兑10 0 0k g精料补充料饲喂试验组羊,将单纯的精料补充料饲喂对照组羊,试验周期为5个月,期间观察、统计羊皮下脓肿病的发病情况。(2)治疗试验:经兽医确定有明显皮下脓肿的羊,先采用外科手术除脓,分成试验组和对照组;试验组羊,用1 0 0g纳米抗菌肽兑10 0 0k g的精料补充料进行饲喂;对照组羊,仅饲喂精料补充料,试验周期为1个月,期间测量脓肿的大小,统计其恢复程度。2 结果与分析2.1 金黄色葡萄球菌的抗生素药敏结果为了更好地了解这些地区金黄色葡萄球菌对常用抗菌药物的耐药性,使用临床上最常用的8种抗生素进行金黄色葡萄球菌药敏试验,发现所有菌株均对青霉素G高度耐药,其次耐药率较高的为苯唑西林、头孢氨苄和氨苄西林,耐药率分别达到6 1.1%、6 1.1%和4 4.4%(表2)。表2
