1、1CS11.020CCS B 41DB3212泰州市地方标准DB3212/T2050-2022鸭甲型肝炎病毒1型与3型荧光定量PCR鉴别诊断技术规范2022-05-10发布2022-05-10实施泰州市市场监督管理局发布DB3212/T2050-20226.1DHAV-1标准品引物上游引物F：5-AACACCTGTTTGGGAGGCAATG-3,下游引物R:5-GGGCAGGGAGTGGAAAGAAGAGGATTGTGCTACCATTGCTGGTG-3,用于扩增目的条带429bp大小的基因片段DHAV-1实时荧光定量PCR引物F:5-CAGGCCAACTCGACCAAT-3,R:5-GGCTT
2、TTTGAGACCCATA-3,探针5-FAM-CACATCAGAGGCAACTTTTGGCAGACT-BHQ1-3.6.2DHAV-3标准品引物上游引物F:5-GCACACTCTTATACAATGGACAATC-3,下游引物R:5-GTGTTGTGTAGGTTGGTGCAGGTAG-3,用于扩增目的条带274bp大小的基因片段。DHAV-3实时荧光定量PCR引物F:5-CCCATTTTATTCTGTTACACCTTTACG-3,R 5-TGTCCAAATATACAACCTGCTAAAAGTC-3,5-VIC-CCCACACGACCCATGCCAGCAT-BHQ1-3。上、下游引物和探针的使用
3、浓度均为10pmol/uL。参考序列见附录B。7病毒RNA提取7.1病毒RNA提取可以使用市售商品化RNA提取试剂盒或实验室操作方法。使用市售商品化RNA提取试剂盒为宜，按照使用说明提取RNA。7.2实验室操作方法7.2.1取250L组织匀浆上清液加入1.5 mL DEPC处理的灭菌指形管（配置方法见附录A.4)中，加入480LRNA提取试剂Trizol,混匀后室温静置5min10min:7.2.2加入200L氯仿，剧烈振荡混匀，室温放置2min3min:7.2.34、12000r/min离心10min,取上清400L,加入0.4mL的异丙醇，反复多次颠倒混匀，-205min:7.2.44、1
4、2000r/min离心10min,弃上清（动作迅速），加70%乙醇(DEP水配置)600L:7.2.54、12000r/min离心5min,倾去液体，瞬离，用微量移液器尽量吸净液体，置超净工作台内放置10minl5min。7.2.6沉淀干燥后加入20L DEPC处理水，轻轻混匀溶解离心管壁上核酸RNA,提取的病毒全基因RNA应在2h内进行反转录扩增或保存于-20冰箱备用。8病毒RNA反转录8.1病毒RNA反转录可以使用市售商品化RNA提取试剂盒或实验室操作方法。使用市售商品化反转录试剂盒为宜，按照使用说明反转录。8.2实验室操作方法反应体系为25L。反应液配置为：依次加入14 L DEPC处理
5、水溶解的RNA,5uL5RT-buffer,1.5L6nt随机引物，2.5LTaq聚合酶缓冲液，1LdNTP(10mmol/L each),0.5LRNA酶抑制剂(20U/L),0.5LAMW反转录酶(5U/uL)。反应条件为：4260min,7015mine9双重实时荧光定量PCR反应9.1反应体系与反应条件双重实时荧光定量PCR反应：12.5L2Premix Ex Taq(Probe qPCR),0.5L50XROXReference Dye,DHAV-1与DHAV-3上下游引物(10mol/L)各0.625L,探针分别为0.75uL与0.5L,1.0LDNA模板，灭菌超纯水7.25uL。反应条件：9530s,955s,6031s;40个循环。9.2试验对照2
