1、动物医学进展,2 0 2 3,4 4(2):8-1 4P r o g r e s s i nV e t e r i n a r yM e d i c i n e猪肺炎支原体、猪圆环病毒2型和3型多重荧光定量P C R检测方法的建立与初步应用 收稿日期:2 0 2 2-0 3-1 0 基金项目:柳州市科技计划项目(2 0 2 0 NA C B 0 8 0 4);南宁市科学研究与技术开发计划项目(2 0 2 0 2 0 9 0);南宁市优秀青年科技人才项目(R C 2 0 1 9 0 1 0 2);贵港市科学研究与技术开发计划项目(桂科计2 1 1 7 0 0 3)作者简介:肖 婷(1 9 9 8
2、-),女,湖南岳阳人,硕士研究生,主要从事基础兽医学研究;何 颖(1 9 7 9-),女,广西柳州人,兽医师,博士,主要从事动物病毒学研究。同等贡献作者。*通讯作者肖 婷1,2,何 颖2,赵 硕2,蒋家霞3,陈忠伟2,郭 旋4,卢冰霞2,林昌华5,赵 武2,秦毅斌2,段群棚2,全琛宇2,许心婷2,陈婷婷2,许艺兰2,胡庭俊1*,张 宁5,6*(1.广西大学动物科学技术学院,广西南宁5 3 0 0 0 4;2.广西兽医研究所/广西兽医生物技术重点实验室,广西南宁5 3 0 0 0 1;3.广西农垦永新畜牧集团新兴有限公司,广西柳州5 4 5 0 0 0;4.广西农垦永新畜牧集团金光有限公司,广西
3、南宁5 3 0 0 4 2;5.广西农垦永新畜牧集团西江有限公司,广西贵港5 3 7 1 0 0;6.广西桂垦牧业有限公司,广西南宁5 3 0 0 2 2)摘 要:为建立一种快速、特异的猪肺炎支原体(M h p)、猪圆环病毒2型(P C V 2)和猪圆环病毒3型(P C V 3)的多重荧光定量P C R鉴别检测方法,根据M h p、P C V 2和P C V 3及-a c t i n基因保守区域序列,设计合成4对特异性引物及4种荧光基团标记的T a qM a n探针。构建含有各目的基因的重组质粒标准品,筛选引物,优化反应条件,成功建立多重荧光定量P C R后评价该方法的特异性、敏感性、重复性并
4、将该方法初步应用于临床样品检测。结果显示,该方法能同时特异性地鉴别检测M h p、P C V 2和P C V 3,检测P R R S V、C S-F V、P R V、J E V、P P V、P E D V、T G E V、FMD V病毒核酸无交叉反应;对M h p、P C V 2、P C V 3和-a c t i n标准质粒的最小检出量分别为2 6.4、6 6.7、2 5.6、5 9 9 0c o p i e s/L;该方法重复性好,组间和组内试验变异系数低于1.5%;用该方法检测1 0 1份临床样本,M h p、P C V 2和P C V 3阳性率分别为2 0.8%、3 6.6%和3 3.7
5、%。建立的多重荧光定量P C R方法能同时快速和定量检测M h p、P C V 2和P C V 3,较普通P C R更敏感,实用性强,有效避免了多次检测耗时长、费用高的问题,为M h p、P C V 2和P C V 3的监测和防控提供了可靠的检测技术。关键词:猪肺炎支原体;猪圆环病毒2型;猪圆环病毒3型;多重荧光定量P C R中图分类号:S 8 5 4.4文献标识码:A文章编号:1 0 0 7-5 0 3 8(2 0 2 3)0 2-0 0 0 8-0 7 猪 支 原 体 肺 炎(M y c o p l a s m a lp n e u m o n i ao fs w i n e,MP S)是
6、由猪肺炎支原体(M y c o p l a s m ah y o-p n e u m o n i a e,M h p)引起的一种慢性呼吸道疾病,具有持续周期长、难治愈、易出现免疫抑制而诱发患病猪继发感染其他病原1,如猪圆环病毒、多杀性巴氏杆菌和猪繁殖与呼吸综合征病毒等2,使病原感染的程度进一步严重,造成较高的病死率,导致养猪业的巨大经济损失。猪圆环病毒(P o r c i n ec i r c o v i r u s,P C V)是圆环病毒科、圆环病毒属的一种呈球形、无囊膜的单股负链环状D NA病毒,是目前已知的具有自主复制能力的最小的动物病毒3。P C V 2(P o r-c i n ec
7、i r c o v i r u s2,P C V 2)首次报道于1 9 9 7年,能够引起 断 奶 仔 猪 多 系 统 衰 竭 综 合 征(P o s t w e a n i n gm u l t i s y s t e m i cw a s t i n gs y n d r o m,PMWS)、猪皮炎肾病 综 合 征(P o r c i n e d e r m a t i t i sn e p h r o p a t h ys y n-d r o m e,P D N S)和繁殖障碍等猪圆环病毒相关疾病(P o r c i n ec i r c o v i r u sa s s o c i a
8、 t e dd i s e a s e,P C VA D)4。2 0 1 6年,P C V 3(P o r c i n ec i r c o v i r u s3,P C V 3)从患有P D N S、繁殖障碍的母猪和关节肿胀、消瘦等疾病的母猪或仔猪中分别被检测到5。临床上P C V 2和P C V 3常以混合感染的方式感染猪群,且症状相似,难以区分6。近年对M h p、P C V 2和P C V 3的检测方法主要有酶联免疫吸附试验(E L I S A)、分离培养等方法和普通P C R及荧光定量P C R等分子生物学方法2,5。这些方法主要存在耗时长、操作繁琐、不能同时鉴别多种病原、敏感性较低
9、及较难分离培养等问题2,7,不利于快速鉴别诊断日趋复杂的混合病原体感染。多重荧光定量P C R是一种具有较高特异性、灵敏性和精确性的实时定量检测特定核酸的技术,可同时鉴别检测多种病原,缩短检测时间,降低检测成本。M h p、P C V 2和P C V 3感染均可引起呼吸系统疾病,DOI:10.16437/ki.1007-5038.2023.02.001且症状相似,临床上很难直接区分这3种病原是单一感染还 是 混 合 感 染。本 文 建 立 了 可 同 时 检 测M h p、P C V 2和P C V 3的多重荧光定量P C R检测方法,并以-A c t i n作为内参基因,为上述病原的临床快速
10、检测以及流行病学调查奠定了技术基础。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 病毒、疫苗毒株及临床样品 本研究所用的猪肺炎支原体(J株)疫苗、P C V 2、P C V 3、猪繁殖与呼吸综合征病毒(P o r c i n er e p r o d u c t i v ea n dr e s p i r a-t o r ys y n d r o m ev i r u s,P R R S V)、猪瘟病毒(C l a s s i c a ls w i n ef e v e rv i r u s,C S F V)、伪狂犬病病毒(P o r c i n ep s e u d o r a b i e sv i
11、 r u s,P R V)、日本脑炎病毒(J a p a n e s ee n c e p h a l i t i sv i r u s,J E V)、猪细小病毒(P o r c i n ep a r-v o v i r u s,P P V)、猪流行性腹泻病毒(P o r c i n ee p i d e m-i cd i a r r h e a,P E D V)、传染性胃肠炎病毒(T r a n s m i s-s i b l eg a s t r o e n t e r i t i so f s w i n e,T G E V)、猪口蹄疫病毒(F o o t-a n d-m o u t h
12、d i s e a s ev i r u s,FMD V)及临床表现呼吸道疫病症状的猪临床病料样品,均由广西壮族自治区兽医研究所病毒研究室于-8 0保存。1.1.2 主要试剂 大肠埃希氏菌D H 5 感受态细胞、p MD 1 8-TV e c t o r、2T a qM a nF a s tq P C R预混液,生工生物工程(上海)股份有限公司产品;病毒基因组D N A/R N A快速抽提试剂盒,A x y g e n生物科技有限公司产品;D N A M a r k e rD L20 0 0,T a k a r a生物技术有限公司产品;胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒,OM E-G A公司产品;其
13、他试剂均为分析纯级别试剂。1.1.3 主要仪器设备 Q u a n t S t u d i o5实时荧光定量P C R仪,美国赛默飞公司产品;凝胶成像系统,美国B i o-r a d公司产品;电泳仪,北京君意东方电泳设备有限公司产品;台式高速离心机,德国S i g m a公司产品。1.2 方法1.2.1 引物和探针合成 M h p引物参照文献8,根据G e n B a n k收录的P C V 2、P C V 3和-A c t i n基因序列,应用P r i m e r5.0软件针对保守序列区域设计特异性的引物及探针(表1)。引物及探针均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。1.2.2 核酸提
14、取 按照抽提试剂盒的操作说明抽提样品核酸,所提取的核酸置-8 0保存备用。使用同样方 法 提 取 收 集 猪 的 组 织 临 床 样 品 核 酸,置-8 0保存备用。1.2.3 阳性标准品构建 对选定的M h p、P C V 2、P C V 3和-A c t i n的保守基因引物序列为:M h p(F:5 -G C C T T G G T AT GA C T G GAT C T C-3,R:5 -C GC GAAAT C C T GAG GAT T T AG-3);P C V 2(F:5 -C C G C G G G C T G G C T GAA C T T-3,R:5 -A C C C C
15、 CG C C A C C G C T A C C-3);P C V 3(F:5 -T T A C T T A-GAGAA C G GA C T T G T AA C G-3,R:5 -AAAT-GAGA C A C AGAG C T AT AT T C AG-3);-A c t i n(F:5 -C T C C AT C AT GAAG T G C GA C G T-3,R:5 -G T GAT C T C C T T C T G C AT C C T G T C-3)。P C R反应条件:9 5 5m i n;9 5 3 0 s、6 0 3 0 s、7 2 3 0 s,4 0个循环;7 2
16、 终延伸1 0m i n。经琼脂糖凝胶电泳试验鉴定条带大小正确后,将产物回收纯化,连接p MD 1 8-T载体并转化感受态细胞大肠埃希氏菌D H 5,经培养后挑取单菌落,筛选出阳性重组质粒进行测序,测序正确的阳性重组质粒作为标准品,分别命名为p MD 1 8-T-M h p、p MD 1 8-T-P C V 2、p MD 1 8-T-P C V 3和p MD 1 8-T-A c t i n,于-2 0 保存备用。根据质粒浓度计算出p MD 1 8-T-M h p、p MD 1 8-T-P C V 2、p MD 1 8-T-P C V 3和p MD 1 8-T-A c t i n的拷贝数分别为2.6 41 01 0、6.6 6 1 09、2.5 6 1 01 0、5.9 9 1 09c o p i e s/L。表1 M h p、P C V 2、P C V 3和-A c t i n的引物与探针序列T a b l e1 P r i m e ra n dp r o b es e q u e n c e so fM h p,P C V 2,P C V 3a n d-A c t i n引物和探针P
