1、论著重组分泌型 配体对肝癌细胞株 凋亡的影响尚小玲，汪宏良，冯琴琴，胡芳，杨浩，谌章舟，黄石市中心医院湖北理工学院附属医院医学检验科，湖北黄石 ；湖北理工学院医学院，湖北黄石 ；肾脏疾病发生与干预湖北省重点实验室，湖北黄石，；黄石市妇幼保健院产科，湖北黄石 摘要：目的构建重组表达 配体（）基因（端含有 信号肽）的慢病毒，探讨其介导肝癌细胞凋亡的可行性及其可能的分子机制。方法将含有 信号肽的 基因克隆至慢病毒载体 （简 称 ）中，然 后 将 重 组 与 慢 病 毒 辅 助 质 粒 共 同 转 染 至 细胞中，获得重组慢病毒 ，阴性对照为 ，分别感染 细胞。最后将成功构建的稳转细胞 及 同时培养至
2、，采用实时荧光定量聚合酶链反应（）检测细胞中相关凋亡信号因子的转录水平，检测蛋白表达水平，检测细胞增殖抑制水平。结果 细胞相对于阴性对照株 ，其凋亡因子转录及表达水平均上调；检测结果显示 细胞生长明显受到抑制。结论外源表达 基因可诱导肿瘤细胞 凋亡，有可能作为肿瘤基因治疗的新途径。关键词：配体；肝癌细胞；慢病毒；凋亡 ：中图法分类号：文章编号：（）文献标志码：，；，；，；，：（），（），（），国际检验医学杂志 年月第 卷第期 ，基金项目：湖北省卫生健康委员会科研基金项目（）；黄石市科技局项目（）；肾脏疾病发生与干预湖北省重点实验室开放基金项目（）。作者简介：尚小玲，女，主管技师，主要从事免疫学
3、检测研究。通信作者，：。网络首发 ：（）：；，；配体（）是一个重要的凋亡途径，对维持机体稳态起着非常重要的作用，可以激活胞内 级联反应，促进细胞骨架降解和 片段化，导致细胞凋亡的发生。凋亡受体 即 ，是一个重要的 受体家族成员，正常情况下在细胞表面跨膜表达，其蛋白相对分子质量为 。是一种可以与死亡受体 结合的细胞因子，它 可 以 通 过 细 胞 毒 作 用 诱 导细 胞 凋亡。在人体内，与其配体 结合后促使 阳性的细胞迅速凋亡。与其配体 的结合可使正常细胞及肿瘤细胞发生细胞凋亡，细胞凋亡是机体抵御癌症的重要防御手段，这种现象最常见于细胞毒性 细胞之中，这种现象是机体排除异常的细胞、清除异物的主
4、要方式。与其配体 都参与维持机体免疫环境的稳定。免疫抑制治疗是通过阻滞某些特定的通路来抵抗肿瘤。细胞是杀灭肿瘤的主力军，其表面可表达多种免疫抑制受体，而肿瘤细胞表面可以产生相应配体。配体通过与细胞表面受体因子的结合，如 的结合，抑制细胞的活化来抑制免疫应答反应。凋亡系统是诱导肿瘤细胞凋亡的重要途径。将分泌型 转染至人肝癌细胞后，分泌到细胞外的 可反作用于肝癌细胞表面凋亡受体 ，触发肝癌细胞内的凋亡信号通路。本研究构建了含有 信号肽序列的 基 因 重 组 慢 病 毒 表 达 载 体 ，利用磷酸钙转染技术将重组慢病毒载体及另外个辅助质粒共转染至 细胞中，制备出具有感染性的缺陷型活病毒粒子，直接感染
5、 细胞，然后检测外源性 基因的分泌性表达对对人肝癌细胞 凋亡的影响。材料与方法材料人肝癌细胞 细胞株、人胚肾细胞 细胞、大肠杆菌 为肾脏疾病发生与干预湖北 省 重 点 实 验 室 所 有；真 核 表 达 载 体 （简 称 ）、购自湖南丰晖生物科技有限公司；及 单克隆抗体购自 公司，及 单克隆抗体购自武汉三鹰生物公 司；、（）、内切酶 、连接酶等分子克隆相关试剂购自 公司；实时荧光定量 （）混合液购自上海翊圣生物公司；胎牛血清购自 公司；嘌呤霉素购自武汉益易普公司；胰酶、双抗、培养基购自美国 公司；人 酶连 免疫吸附测法（）试剂盒购自江苏酶标生物科技有限公司公司；试剂盒购自碧云天公司；二抗 山羊
6、抗兔 （）抗体和 山羊抗鼠 （）抗体购自安迪福诺生物科技武汉有限公司；裂解缓、超敏发光液购自北京普利莱公司；引物均由武汉奥科公司合成。方法细胞培养人肝癌细胞 及人胚肾细胞 分别用含 胎牛血清、双抗（）的培 养 液 置 于 、条 件 下 培 养，胰蛋白酶（含 ）消化传代。重组慢病毒载体 的构建与鉴定以 质粒为模板，设计引物 扩 增 片 段，引 物 序 列：，：。利用 和 两种限制性内切酶同时酶切 和扩增片段，分别纯化和回收双酶切后的载体 和 片段，在 连接酶作用下将带有缺口的 载体和 片段连接（连接），转化到感受态细胞 中，过夜培养。经双酶切、菌液 及琼脂糖凝胶电泳鉴定重组质粒 ，最后将重组质粒
7、送武汉奥科公司测序。重组慢病毒 和阴性对照病毒的制备及对 细胞的感染培养 细胞，长满后接种到个直径为 的培养皿中，待其生长至密度约为 左右开始转染，其中个培养皿用于重组慢病毒载体转染，个培养皿转染阴性对照慢病毒载体（不含 ）。按照分子克隆实验磷酸钙转染法进行 操 作，同 时将 、质粒以、的量用磷酸钙混合液转染至 细胞中，于 、条件下培养至。然后在倒置荧光显微镜下观察转染后的结果，若 细胞表达绿色荧光蛋，证明慢病毒质粒转染成功。构建的重组慢病毒记为 ，阴 性 对 照 慢 病 毒（不 含 ）记为。回收细胞培养基直接感染 细胞，待 后加入终浓度为 的嘌呤霉素处理细胞，每天加次，持续，最终获得全部被慢
8、病毒感 染 的 细 胞，阳 性 命 名 为 细胞，阴性命名为 细胞。国际检验医学杂志 年月第 卷第期 ，检测 蛋白的分泌培养 和 细胞至第，收集两种细胞的培养基，按照人 试剂盒说明书操作，用酶标仪在单波长 处测定吸光度值（），每个样品设置个平行重复检测。检测细胞生长情况将 、作 为 空 白 对 照（）细胞分别以 孔的密度种在 孔板中，每种细胞设置个平行重复检测，于 、条件下培养至 后按照 试剂盒说明书进行操作，用酶标仪在单波长 处测定种不同细胞的吸光度值（）。检测凋亡因子的转录水平培养稳转细胞 和 ，在第 对 、相 关 死 亡 域 蛋 白（）等凋亡相关基因的表达进行 检测。按 法提取组细胞总，
9、取总 约，反转录合成 ，反应体积为。以 作为内参，取合成的 进行上述凋亡基因的 检测，每个样本设置个平行检测，引物序列见表。所有反应体系配制好后，置于 仪进行检测，反应条件为 ，共 个循环。当 反应运行结束，导出数据并在 软件中进行统计学分析和作图。表实时荧光定量 引物序列基因引物序列（）正向：反向：正向：反向：正向：反向：正向：反向：正向：反向：检测凋亡因子的蛋白表 达水平分别收集 、种细胞，用刮铲刮取细胞，每个样品加 裂解缓冲液冰上裂解 ，根据 蛋白定量试剂盒说明书操作，用 多功能酶标仪测定总蛋白，根据总蛋白水平确定上样量。进行 电泳，条件为 、。然后转膜（尼龙膜），转膜，用浓度为的牛奶缓
10、冲液室温下封闭，分别与 、及 一抗孵育，过夜。洗涤次，每次 ，后与相对应的二抗室温孵育，用 重复洗次，每次 。最后用 超敏发光液孵育后置于 迷你化学发光成像仪显色。以 作为内参，用 软件测灰度值，计算上述蛋白的相对表达水平（以目的蛋白的灰度值与 灰度值的比值表示）。每个样本设置个平行重复检测。统计学处理采用 软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以表示，组间比较采用 检验，为差异有统计学意义。结果重组慢病毒载体 的构建与鉴定挑取单克隆培养菌株（非蓝白斑筛选），进行菌液 扩增，筛选 阳性质粒，产物经过琼脂糖凝胶电泳鉴定，可以发现有约 的 片段，同时抽提阳性重组质粒进行双酶切鉴定，酶切产物经琼
11、脂糖凝胶电泳显示，出现约大于 和约 两条带，与预期结果相符。最后，将阳性质粒送武汉奥科公司测序，将 数据库的序列与测序结果进行对比，证明序列完全一致。重组慢病毒的制备 后在倒置荧光显微镜下观察，发现 细胞表达绿色荧光蛋白，说明慢病毒质粒制备成功。检测 蛋白的细胞外分泌情况 细胞培养基 为 ，细胞培养基 为，差异有统计学意义（），说明加入 信号肽的 蛋白能够分泌到细胞外。检测细胞生长情况 细胞 最高，为 ；细胞 为；细 胞 最 低，为；种细胞间两两比较，差异均有统计学意义（）。与其他两种细胞比较，细胞生长受到了明显抑制，细胞外分泌的 蛋白对 细胞具有抑制作用。检 测 凋 亡 因 子 的 转 录
12、水 平 细 胞 中 、的相对表 达水 平 分 别 为 细胞的 、倍，其中 、的表达差异有统计学意义（）。凋亡因子蛋白表达水平的 检测 细胞的检测中，有条带检出，其余 种细胞未检测出明显条带；而 和 在所有细胞中均有条带检出。蛋白国际检验医学杂志 年月第 卷第期 ，在 细胞中的相对表达水平为，明显高于该蛋白在其他两种细胞中的相对表达 水 平（）；和 蛋 白 在 细胞中的相对表达水平分别为 和，也明显高于这两种蛋白在其他细胞中的表表达水平（）。见图。注：表示作为空白对照的 细胞；表示 细胞；表示 细胞；为 条带图；、分别为 、蛋白在种细胞中的相对表达水平比较。图细胞凋亡因子的 条带检测图及各泳道蛋
13、白相对表达水平分析讨论本研究采用慢病毒作为 基因的运载工具，将其有 效 地 整 合 到 宿 主 染 色 体 上，达 到 在 细胞中持久性表达的目的。同时克服了一般运载分子的缺点，如使生物大分子构象改变、活性部位易受到影响、药效降低和毒副作用等 。通路在胞内具有双重调控作用。一方面，与靶细胞表面受体 结合，使 细胞质区的死亡结构域（）与转接器蛋白的 结合，形成死亡诱导信号复合体（），进而激活下游的凋亡蛋白，从而介导细胞凋亡以保证功能异常细胞能够被及 时 清 除，在 免 疫 监 测 中 扮 演 着 十 分 重 要 的 作用 。另一方面，当 介导的细胞凋亡发生了异常改变，引起一系列的不良反应，继而对
14、人体造成不良的影响。研究证明 或 的不正常表达可能与细胞损伤、生殖系统疾病、免疫疾病、神经系统病变、炎症反应、肿瘤发生有关。高彦军等 发现，动物实验组中大鼠肺组织 出 现 显 著 病 变 并 伴 有 凋 亡 迹 象，随 着 刺 激 物 水 平 增 加，凋 亡 水 平 也 增 加，而 且 证明 、等蛋白的表达随 的增加而增加。因此 的有效暴露可以诱导实验动物肺上皮细胞发生 途径介导的凋亡。戴芳等 通过对 例临床精液标本进行分析，发现弱精组、少精组和少弱精组中 表达水平与正常组相比均偏高，但与精子浓度、前向运动精子数呈负相关，差异有统计学意义（）。同时，少精组和少弱精组中 转录水平上调，转录水平与
15、前向运动精子和精子活力呈正相关，差异有统计学意义（）。该研究初步证实 在转录及表达水平的异常促进了精细胞凋亡。有研究发现纳米二氧化硅通过诱导小鼠睾丸 细胞氧化应激反应，激活 通路，促使 细胞发生凋亡，且纳米二氧化硅表现出剂量依赖性地抑制 细胞的存活率和数量。毒性弥漫性甲状腺肿（）患者 治疗前后的对比分析得出，观察组中外周血 表达水平高于对照组，缓解组、复发组的 表达水平均高于对照组，缓解组 表达水平低于观察组和复发组，所有对比均有统计学意义（）。由此可见，在外周血中的表达水平随着 病程的发展而升高。还有类似研究显示慢性淋巴细胞性甲状腺炎患者经硒酵母联合地塞米松治疗后，血清中 和 的蛋白表达水平
16、明显降低，患者的甲状腺功能明显改善。通路在神经系统疾病中也扮演重要角色，研究人员发现在对难治性癫痫患者予以左乙拉西坦联合鼠神经生长因子治疗半年后，可有效控制癫痫发作，提高临床疗效，且 、等蛋白水平也显著低于对照组（），说明 通路参与了癫痫的发病过程。通路是维持机体组织正常生理功能的重要信号通路。研究证明，和 广泛表达于人体组织细胞中，一但机体组织细胞功能遭到破坏，就会直接导致 凋亡通路无法执行凋亡程序，启动异常细胞的死亡，造成机体相关组织细胞走向不可逆转的癌变。结肠癌细胞中 高表达，但过表达 蛋白却又阻断 通路，抑制人结肠癌细胞 凋亡。辣椒素可以抑制人胃癌细胞 的活力，促进 通路介导的细胞凋亡。研究人员还发现肝癌和上皮性卵巢癌组织中存在 跨膜表达的下调和 跨膜表达增加的情况，这样肿瘤细胞表面 受体无法被免疫细胞识别，同时肿瘤细胞表面异常表达的 配体又会结合免疫细胞膜表面受体 从而诱导免疫细胞国际检验医学杂志 年月第 卷第期 ，自身凋亡，以此来逃避宿主的免疫应答 。目前，治疗肝癌的主要方法以手术、放射介入、化疗为主，但整体疗效有限，多数患者就诊时已属肝癌晚期，不符合手术治疗范围，化学药物
