1、2023 年 第 4 卷 第 1 期|Synthetic Biology Journal 2023，4（1）：225-240基因增变器驱动的酿酒酵母基因组连续进化潘颖佳1，2，夏思杨1，董昌2，蔡谨1，连佳长1，2（1 浙江大学化学工程与生物工程学院，浙江 杭州 310027；2 浙江大学杭州国际科创中心，浙江 杭州 310000）摘要：酿酒酵母是工业生物技术最常用的底盘细胞之一，被广泛应用于生物基化学品和高附加值产品的大规模生产。鉴于生物体系代谢和调控网络的复杂性，由多基因协同控制的复杂生理性状的改造通常需要采取全基因组进化来实现。为实现酿酒酵母基因组的快速进化，本研究采用CRISPR干扰技
2、术（CRISPRi）调控与染色体复制和稳定性相关基因（MSH2、TSA1、RAD27和CLB5，即增变基因）的表达水平，构建了能够调控酿酒酵母基因组突变率和突变类型的基因增变器。利用基因增变器提高酿酒酵母的-胡萝卜素合成水平、木糖利用效率和异丁醇耐受性。此外，构建了混合基因增变器和多重基因增变器，进一步探究了不同表型基因组进化所需的最佳突变类型以及不同突变类型之间的协同进化机制。本研究不仅可用于创建高性能酿酒酵母细胞工厂，还有可能发展一个具有普遍适用性的基因组连续进化策略。关键词：基因增变器；酿酒酵母；基因组连续进化；CRISPR干扰；增变基因中图分类号：Q812 文献标志码：AMutator
3、-driven continuous genome evolution of Saccharomyces cerevisiaePAN Yingjia1，2，XIA Siyang1，DONG Chang2，CAI Jin1，LIAN Jiazhang1，2（1Key Laboratory of Biomass Chemical Engineering of Ministry of Education，College of Chemical and Biological Engineering，Zhejiang University，Hangzhou 310027，Zhejiang，China；2
4、ZJU-Hangzhou Global Scientific and Technological Innovation Center，Zhejiang University，Hangzhou 310000，Zhejiang，China）Abstract:Saccharomyces cerevisiae,one of the most commonly used cell factories for industrial biotechnology,is widely employed for mass production of bio-based chemicals and value-ad
5、ded compounds.Due to complicated cellular metabolism and regulatory network of biological systems,genome evolution is generally required for engineering with complicated phenotypes,which are coordinated and regulated by multiple genes.To achieve rapid evolution of S.cerevisiae genome,this study empl
6、oyed Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats Interference(CRISPRi)to regulate the expression of genes closely related to chromosome replication and maintenance,such as MSH2,TSA1,RAD27,and CLB5,known as mutator genes.By designing guide RNAs(gRNAs)with differential repression efficie
7、ncy,four mutators:MSH2 mutator mainly for point mutations and small InDels(MM),TAS1 mutator 收稿日期：2022-09-21 修回日期：2022-12-14基金项目：国家自然科学基金（21808199）；国家重点研发计划（2018YFA0901800&2021YFC2103200）；浙江省杰出青年基金（LR20B060003）；中央高校基本科研业务费专项资金（226-2022-00214）引用本文：潘颖佳，夏思杨，董昌，蔡谨，连佳长.基因增变器驱动的酿酒酵母基因组连续进化 J.合成生物学，2023，4（1
8、）：225-240Citation：PAN Yingjia，XIA Siyang，DONG Chang，CAI Jin，LIAN Jiazhang.Mutator-driven continuous genome evolution of Saccharomyces cerevisiaeJ.Synthetic Biology Journal，2023，4（1）：225-240DOI:10.12211/2096-8280.2022-051研究论文合成生物学 第 4 卷mainly for point mutations,small InDels,and structural variants(T
9、M),RAD27 mutator mainly for small InDels and structural variants(RM),and CLB5 mutator mainly for structural variants and aneuploidy chromosomes(CM)were constructed to control genome mutation rates and types(e.g.point mutation,small InDels,structural variants,and aneuploid chromosomes).These mutators
10、 were used for continuous evolution of a series of industrially relevant phenotypes,such as isobutanol tolerance,xylose utilization,and-carotene biosynthesis.Interestingly,TM was more efficient for evolving isobutanol tolerance,but TM and CM were preferred for evolving-carotene overproduction,and al
11、l mutators were verified to have comparable performance for evolving xylose utilization with yeast strains.We also discovered that the effectiveness of mutators was dependent on the phenotype to be evolved.To address challenges in the evolution of phenotypes without pre-determined knowledge on mutat
12、ion rates and types,a mixed mutator(MTRC)was constructed to rapidly evaluate the mutator-phenotype relationship.Finally,a combinatorial mutator(MTRC*2)were constructed to explore synergistic interactions among various mutators for the continuous genome evolution of S.cerevisiae.The established mutat
13、ors can not only be used for constructing robust yeast cell factories,but also be further developed as a generally applicable genome evolution tool.Keywords:mutators;Saccharomyces cerevisiae;continuous genome evolution;CRISPR Interference;mutator genes基因组进化是模拟自然进化过程，通过人为产生基因多样性和功能筛选的迭代循环，快速获得具有目标性状的
14、工程菌株1-2。传统的诱变育种、全局转录因子工程以及实验室适应性进化等基因组进化工程虽然已被广泛应用于创建高性能的酿酒酵母细胞工厂3，但是这些方法均采用“先突变后筛选”的工程策略，需要进行多轮迭代的诱变选择和频繁的人工干预，导致菌株改良过程不连续且低效4。相比之下，连续进化可在最小的人工干预下，将翻译、选择、复制和突变（达尔文进化的四个过程）集成一个不间断的循环5-6。基因组连续进化解决了现有进化工程方法的不连续性，提高工程效率，遵循“边突变边筛选”原则，大大简化了菌株选育过程，是获得满足工业生产所需高性能酿酒酵母细胞工厂的主要手段之一7-8。226第 4 卷 突变的遗传基础是存在许多基因和途
15、径，能够在基因的复制、修复、重组等过程中防止发生诱变，确保基因序列和染色体数目的准确性9。然而，当这些基因存在缺陷时，与野生型菌株相比能够提高突变率，这种与突变的发生和抑制相关的基因称为增变基因（mutator genes）10，也就是说，增变基因可通过提高基因组突变率而加速细胞的进化。之前有报道指出，降低基因组复制过程的保真性能够提高突变率，可有效实现基因组连续进化4，11。敲除酿酒酵母基因组复制过程中稳定性相关的基因会显著提高基因组突变率12-13，同时不同的增变基因能够引发不同的突变类型13，如 MSH2（点突变和小片段增删）、TSA1（点突变和小片段增删）、RAD27（小中长片段增删）
16、、CLB5（长片段增删和染色体畸变）、MEC1TEL1（染色体畸变）等13-19。前期研究表明，在构建工程菌株过程中，不同进化表型往往需要相应的基因组突变率或突变类型，如较低的突变率有利于进化乙酸耐受性20，进化丁醇耐受性则需要较高的突变率4，而染色体畸变是提高酿酒酵母耐热性的主要分子机制21。基因敲除的手段会导致不可恢复的高频突变，无法直接适用于构建工业生产所需的稳定菌株。而基于CRISPR干扰技术（CRISPRi）的质粒可以在酿酒酵母细胞中稳定表达，突变菌株在压力筛选条件下成功进化后可将质粒从酿酒酵母细胞内剔除，因此可以在基因增变表型和稳定表型之间灵活互换22。此外，CRISPRi 效率主要受 gRNA序列与靶标序列的结合能力和结合位置的影响，也就是说增变基因的表达水平（基因组突变率）可通过设计和构建gRNA文库进行精确调控，以满足不同基因组进化的需求23。如图1所示，本研究利用 CRISPRi体系调控一个或者多个增变基因的表达水平，不仅能够在酿酒酵母基因组中诱导产生不同类型的突变，还能够调控基因组的突变率，实现突变率和突变类型协同控制的基因组连续进化。图图1基于增变基因的酿酒酵母
