1、I C S7 30 8 0Q6 4备案号：3 0 0 2 4 2 0 1】C中华人民共和国建材行业标准J C T5 4 22 0 1 0代替J C T5 4 21 9 9 4滑石粉微生物学检验方法M e t h o do fm i c r o b i o l o g ye x a m i n a t i o nf o rt a l cp o w d e r2 0 1 0 11 2 2 发布2 0 11 0 3 0 1 实施中华人民共和国工业和信息化部发布如下刖吾本标准按照G B T1 1 2 0 0 9 给出的规则起草。本标准代替J C T5 4 2-1 9 9 4 (2 0 0 2 版)中化
2、妆品微生物检验方法，菌落总数定义2 3 检验通则31 取样及注意事项311 每批滑石粉应随机抽两个或两个以上包装完好的单位，试样量不少于1 0g，以使检验结果具有代表性。312 凡异常的供试品，则选取有疑问的样品进行检验。凡包装开启即可见霉变的，无需检验则可判为不合格。313 在检验前，应严格保持包装的原有状态，并放在阴凉干燥处，防止因微生物再度繁殖而影响检验结果。凡原包装已启开，则不在其中取样。314 样品的稀释，须在1h 2h 内完成，以防止微生物繁殖或死亡。315 微生物检验全过程，必须在无菌操作条件下进行。凡直接与样品接触的用具，均应事先灭菌并保持无菌。316 从样品检出致病菌的报告发
3、出之日起，该菌菌种需保存一个月备查，阴性样品可及时处理。32 供试液制备的材料和仪器。3 21 天平：感量不大于0 1g。3 22 三角烧瓶：3 0 0m L 或5 0 0m L。3 23 玻璃珠：彰5m m。3 24 量筒：1 0 0m L。3 25 电炉。326 高压消毒锅。3 27 滤纸。33 供试液的制备方法准确称取1 0 og 试样，放人装有9 0m L 稀释剂(p H 7 0 无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液)和十几个玻璃珠的三角烧瓶中，经振摇制成1：1 0 的试液备用。取用时必须混匀。34 阳性菌株对照试验1J C T5 4 2 2 0 1 03 41 每次检验，应同时进行阳性对照生长试
4、验。3 42 对照试验加人的已知活菌量，每批样品应控制在5 0 个1 0 0 个范围之内。3 43 常用的阳性对照菌株，卫生部检定所编号：大肠杆菌4 4 1 0 2、绿脓杆菌1 0 1 0 4、金黄色葡萄球菌2 6 0 0 3 等。3 44 做阳性菌株对照试验时，应注意安全，严格防止对照菌污染样品和环境。4 细菌总数测定方法41 方法原理每种细菌有其一定的生理特性，生长时对营养、温度、时间、p H 值、需氧性等的要求均不相同。在实际培养中，不可能同时满足所有细菌的要求，因此只能测定在营养琼脂上发育的嗜中温性需氧及兼性厌氧的细菌菌落总数。42 材料和仪器4 21 恒温培养箱。4 22 电热恒温水
5、锅。42 3 移液管：lm L 及1 0m L。424 平皿：g9 0m m。42 5 试管：1 8m i l l 2 0 0m m。42 6 试管架。42 7 放大镜。43 培养基和试剂4 3 1营养琼脂培养基。4 3 2生理盐水：定量分装于试管(每支试管内9m L)。44 试验程序1z1 0 试液做几个连续倍数的稀释液+选择2 个3 个连续稀释度，各加1m L 于相应平皿+平皿加入1 2m L 1 5m L 营养琼脂3 6 土1 4 8h+2h菌落计数45 试验步骤4 51 试液稀释及培养4 511 用1 m L 移液管取1：1 0 试液1 m L，沿管壁加入盛有9 m L 盐水的试管(管
6、的尖端不要触及液面)，振摇试管，做成1：1 0 0 均匀稀释液。4 512 另取l m L 移液管，按4 5 1 1 操作制1 0 倍递增稀释液，每次更换一支移液管，稀释至1 0 1 1 0 _ 5 倍。4 5 13 选择2 个3 个连续稀释度，用吸取该稀释度的移液管，移1m L 试液于平皿内，每个稀释度做2 个3 个平皿。4 514 将预先放在4 5。C 土1 恒温水浴中的营养琼脂培养基，加人平皿约1 5m L，并转动平皿混合均匀。同时再将营养琼脂1 5m L 倾斜加人装有1m L 不含试样的稀释剂平皿中，作为空白对照。4 515 琼脂凝固后，翻转平皿，置3 6 C 1 培养箱内，保持4 8
7、h 2h 后取出，进行菌落计数。平皿J C T5 4 2 2 0 1 0菌落数乘以稀释倍数，即为每克样品所含菌落总数。4 52 计数方法4 5 21 用肉眼观察，必要时用放大镜。4 5 22 求出同一稀释度各平皿的菌落平均值。若平皿中有连成大片的菌落生长，该平皿不宜计数。若片状菌落不到平皿的一半，其余一半的分布又很均匀，可将此半个计数后乘以2，代表全皿。4 523 选择平均菌落数在3 0 3 0 0 之间的平皿，作为菌落总数的测定范围。当只有一个稀释度符合此范围，即以该平皿菌落数乘以稀释倍数(见表1 中例1)。4 524 有两个稀释度，平均菌落数均在3 0 3 0 0 之间，则应求出两者菌落总
8、数之比值决定。小于或等于2，报告其乎均数；大于2，则报告其中较小的菌落数(见表1 中例2、例3)。4 5 25 所有稀释度，其平均菌落数均大于3 0 0 个，则按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数(见表1 中例4)。4 5 26 所有稀释度的平均菌落数均小于3 0 个，则按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数(见表1中例5)。4 527 所有稀释度的平均菌数落均不在3 0 个3 0 0 个之间，则以最接近3 0 或3 0 0 的乘以稀释倍数(见表1 中例6)。4 528 所有稀释度均无菌落生长，为每克小于1 0C F U。4 53 报告菌落数在1 0 0 以内，按实数值报告；大于1 0 0，采用
9、二位有效数字乘以1 0 的指数来表示，有效数字后面的数值用修约法处理。以C F U g 为计量单位。(C F U：菌落形成单位)表1菌落计数结果及报告方法不同稀释度的平均菌落数两稀释度菌落总数报告方式例次l O1l O 一2l o 一3菌数之比C F U gC F U gl13 6 51 6 42 01 64 0 016 1 0 4227 6 02 9 54 61 63 8o o o3 8 1 0 4328 9 02 7 06 02 22 7 l O O27 1 0 44不可计46 5 05 1 35 1 3o o o51 1 0 552 71 152 7 02 7 1 026不可计3 0 5
10、1 23 05 0 031 1 0 45 真菌总数测定方法51 方法原理真菌具有明显的细胞核，多数需氧，在偏酸含糖的培养基中，在较高湿度2 5 2 8 的温度条件下生产良好。本方法根据这些生物特性，进行培养和菌落计数。52 材料和仪器5 21 恒温培养箱。5 22 振荡器。523 电热恒温水浴锅。5 24 试管：15m m 1 5 0m m。5 25 移液管：1m L 和1 0m I。5 26 平皿：9 9 0m m。J C T5 4 2 2 0 1 05 27 生物显微镜。5 28 载玻片、盖玻片。53 培养基和试剂豁3 1沙保罗琼脂培养基。53 2蒸馏水：定量分装于试管(每支试管9m L)
11、。54 试验程序1：1 0 试液振荡3 0 r a i n做几个连续倍数的稀释液选择3 个连续稀释度，各加1m L 于相应平皿每皿加入1 2m L 1 5m L 培养基2 5 2 8 07 2h菌落计数5 5 试验步骤5 5 1 试液稀释及培养5511 将1：t 0 试液暨振荡器中，振荡3 0 m i n，使真菌孢子充分散开。5512 按4 5 1 1、4 5 1 2 中规定的稀释方法，将试液稀释至1 0-1 1 0 一。5513 根据试样污染程度，选择3 个连续稀释度，分别移1m L 稀释液于相应平皿中。每个稀释度做2 个3 个平皿。然后将预先放在水浴锅中的4 5 土1 的沙保罗琼脂培养基，
12、分别加入约1 5m L，并转动平皿，混合均匀。同时按细菌总数溅定中的方法，作空白对照。5514 待琼脂凝固后，倒置于2 5 2 8 培养箱中，保持7 2h i 2h 后取出，进行菌落计数。5 5，2 计数方法用肉眼观察，选择同稀释度平均菌落数在5 个5 D 个之间的，乘以稀释倍数，作为真菌总数。计数和报告中所逼到的各种情况，按4 5 2 的规则处理。注：计数时，如不能肯定是真菌，可取培养物涂片，直接镜检或革兰氏染色后镜检。6大肠菌群和粪大肠菌群检验方法61 方法原理根据其所具有的生物学特性，如革兰氏阴性无芽胞杆菌，分别在3 7 和4 4 条件下，保持2 4h 4 8h能发酵乳糖、产酸、产气，并
13、能在选择性培养基上产生典型菌落，能分解色氨酸，产生靛基质等。62 材料和仪器621 恒温培养箱。6 22 电热恒温水浴。6 23 试管及小倒管：1 5m m 1 5 0m m。6 24 移液管：1m L、1 0m L。6 25 平皿：刃9 0m m。6 2 6p H 试纸。6 27 生物显微镜。6 28 载玻片和盖玻片。63 培养基和试剂6 31 乳糖胆盐培养基。46 32 乳糖发酵培养基液。6 33 伊红一美兰琼脂(E M B)。6 34 蛋白胨水。6 35 靛基质试剂。6 3 6 革兰氏染色。6 4 试验程序1：1 0 试液l做三个连续稀释度l乳糖胆盐发酵管3 6 1 I4 8 h厂不产酸
14、、不产气产酸、产气J 厂阴性乳糖胆盐发酵管证实试验4 4 I4 8 hl厂 厂不产酸、产气产酸、产气E M B 平板乳糖发酵l阴性广靛基质试验E M B 平板3 6 I Cl2 4 h染色镜检6 5 试验步骤651 试液稀释6511 用1：1 0 试液，按4 5 1 _ 1、4 5 1 2 中的方法做1 0 倍递增稀释液。6 51 2 根据样品的污染情况，选择三个连续稀释度。6 52 大肠菌群6 5 21将试液分别接种于预先装有1 0m L 乳糖胆盐培养基的试管内，每管1m L，每一稀释度接种3管，在3 6o c 1 培养4 8h，如所有试管内部不产酸、不产气，则可报告大肠菌群阴性。如有产气、
15、产酸者则需按6 5 2 2 进一步做证实试验。6 5 22 划线接种于E M B 平皿，在3 6 C 土1 培养1 8h 2 4h 取出观察形态，挑取可疑菌落做染色镜检，同时做乳糖发酵试验，凡乳管产气、镜检为革兰氏阴性无芽胞杆菌，即可报告大肠菌群阳性。6 53 粪大肠菌群6 5 31将第一次产酸、产气的乳糖胆盐培养物，分别以1m L 接种于各乳糖胆盐发酵管内，置于4 4。C0 5 水浴锅，培养2 4h 2 8h。如所有乳糖胆盐发酵管都不产酸、不产气，则可报告粪大肠菌群阴性；如产酸、产气，则进行6 5 3 2 6 5 3 5 程序。6 5 32 划线接种于E M B 平皿，在3 6。C 土1 培
16、养1 8h 2 4h，同时接种于蛋白胨水，在置于4 4。C 05 培养2 4h。6 5 33 经培养后，在E M B 平皿上，典型粪大肠菌群菌落，呈深紫黑色、圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，常见有金属光泽。也有的呈紫黑色，不带或略带金属光泽，或粉紫色，中心较深的菌落。6 5 34 挑取上述可疑菌落，涂片做革兰氏染色镜检。6 5 35 在蛋白胨水培养液中，加入靛基质试剂0 5m L，阳性反应则液面呈现玫瑰红色，阴性反应液面呈试剂本色。6 5 36 平皿上有典型菌落，经证实为革兰氏阴性短杆菌，靛基质试验阳性，则报告粪大肠菌群阳性。7 铜绿假单胞菌检验方法71 方法原理根据本菌生物学特征，革兰氏阴性杆菌氧化酶试验阳性，能产生铜绿假单胞菌素。此外还能液化明胶，还原硝酸盐为亚硝酸盐，在4 2 C 条件下生长等，可与类似菌相区别。72 材料和仪器7 21 恒温培养箱。7 22 冰箱。7 23 三角烧瓶：5 0 0m L、3 0 0m L。724 试管：髟1 8I T l t l 2 0 0m m。7 25 平皿：髟9 0m m。7 26 移液管：1m L、1 0m L。727 生物显微镜。7 28
