1、LOGO 小分子肝素小分子肝素的制备的制备 陈紫娟 LOGO 目目 录录 概述概述 1 制备方法制备方法 2 酶活测定方法及分子量测定方法酶活测定方法及分子量测定方法 3 实验进度及问题实验进度及问题 4 LOGO 1 1 概述概述 肝素肝素（Unfractionated heparin,UFH）作为抗凝剂和作为抗凝剂和抗血栓药在临床上使用已有抗血栓药在临床上使用已有60余年余年，但长期使用会导但长期使用会导致出血和血小板减少等不良现象致出血和血小板减少等不良现象。低分子肝素低分子肝素(Low-molecular-weight heparin,LMWH)是由普通肝素裂解而来是由普通肝素裂解而来
2、。与普通肝素比较与普通肝素比较，其抗血栓其抗血栓能力较强而抗凝血能力较低能力较强而抗凝血能力较低，在其抗血栓能力形成时在其抗血栓能力形成时对凝血系统的影响较小对凝血系统的影响较小。另外低分子肝素还具有分子另外低分子肝素还具有分子量小量小、生物利用度高生物利用度高、体内半衰期长体内半衰期长、出血倾向小等出血倾向小等特点特点，因此低分子肝素的制备具有重要的意义因此低分子肝素的制备具有重要的意义。LOGO 根据其末端链的差异和制备方法的不同，低分子肝素主要分为八种。平均分子量平均分子量 制备方法制备方法 FXa/Fa的比例的比例 末端链末端链 那屈肝素 依诺肝素 达肝素 舍托肝素 亭扎肝素 瑞维肝素
3、 阿地肝素 帕肝素 4500 3500-5000 4000-6000 4500-8000 4900 4000 6000 5000 亚硝酸降解 乙醇分级 苯甲化并碱降解 亚硝酸降解 凝胶过滤 亚硝酸异戊酯降解 肝素酶降解 亚硝酸降解 过氧化氢降解 过氧化氢降解 3.6 3.8 2.0 4.2 1.9 5.0 1.9 2.0 2，5-脱水-D-甘露糖还原末端 4，5-不饱和糖醛酸非还原末端 2，5-脱水-D-甘露糖还原末端 2，5-脱水-D-甘露糖还原末端 4，5-不饱和糖醛酸非还原末端 2，5-脱水-D-甘露糖还原末端 不稳定的糖苷键 不稳定的糖苷键 LOGO 2 2 制备方法制备方法 化学裂解
4、法化学裂解法 亚硝酸降解法、过氧化氢降解法、-消除降解法和其它化学降解法 制备方法制备方法 物理分离法物理分离法 有机溶剂分级沉淀法、凝胶色谱法、亲和色谱法、离子交换色谱法和超滤法（不适用与工业化生产）酶解法酶解法 肝素酶 LOGO 2.1.1亚硝酸降解法亚硝酸降解法 肝素钠肝素钠 溶液溶液 降解液降解液 中和液中和液 沉淀沉淀 低分子肝素低分子肝素 2.1 2.1 化学降解法化学降解法 1%醋酸 PH 2.3-3.0 亚硝酸钠-530，3.5h 氢氧化钠中和 PH 6.5-7.0 无水乙醇 丙酮脱水，干燥 该解聚肝素的过程受温度、溶液该解聚肝素的过程受温度、溶液pH值、亚硝酸盐的浓度及降解值
5、、亚硝酸盐的浓度及降解时间的影响较大。时间的影响较大。LOGO 2.1 2.1 化学降解法化学降解法 2.1.2 过氧化氢降解法过氧化氢降解法 肝素钠肝素钠 溶液溶液 溶液溶液 反应液反应液 浓缩液浓缩液 中和液中和液 沉淀沉淀 低分子肝素低分子肝素 该法制备该法制备LMWH 的过程也主要受反应的温度、的过程也主要受反应的温度、pH值和过氧化氢浓度的影值和过氧化氢浓度的影响响 乙酸钠 PH 7.8 抗坏血酸、乙酸铜水溶液 PH 7.8 边搅拌边加入过氧化氢 PH 7.8，40，24h 真空浓缩 EDTA钠盐 PH 6.5-6.7 无水甲醇 干燥 LOGO 2.1 2.1 化学降解法化学降解法
6、2.1.3 2.1.3 -消去降解法消去降解法 -消除降解法包括肝素季铵化和降解两步处理。肝素的季铵盐和卤代烃或卤代苄基化合物在二氯甲烷或二甲基甲酰胺中可以发生酯化反应,生成的肝素酯可在碱性条件下水解成LMWH。肝素解聚程度可由酯化率，碱性条件或酯的类型决定。2.1.42.1.4其它化学降解法其它化学降解法 除亚硝酸降解、-消除降解法和过氧化氢降解这三种工业上用来制备LMWH的化学方法以外，还可采用高碘酸降解、次氯酸降解、-照射和硫酸一氯磺酸降解等几种方法制备LMWH。这几种制备方法目前没有其投入工业化生产的报道。LOGO 2.1 2.1 化学降解法化学降解法 优点：化学裂解法工艺简单，成本低
7、廉，适宜工业化生产。缺点：化学裂解法在裂解过程中容易导致硫酸基丢失ATlll一结合部位减少，同时其在裂解过程中易引入有毒物污染环境。LOGO 2.2 2.2 酶解法酶解法 肝素的酶法降解己经被用作分析肝素的结构和制备LMWH。肝素酶是能特异性的裂解肝素和类肝素主链糖苷键的酶，最初是从肝素黄杆菌（Flavobacterium heparinum）中发现并分离。后在一些其它的微生物和真核生物中也有发现，如拟杆菌属、棒杆菌属和芽孢杆菌属等几种，真核生物的霉菌、胎盘、胸腺、血小板等中均有发现。肝素酶主要用于低分子肝素生产和链上精确结构的研究，现在市场上肝素酶价格昂贵且都是肝素黄杆菌肝素酶，这是由于分离肝素酶稳定性差及产量不高所造成的。LOGO 2.2 2.2 酶解法酶解法 微生物微生物 方法方法 构建高效表达且 不易产生包涵体 的基因工程菌 基因工程基因工程 方法方法 相较化学裂解法，酶解法裂解环境温和、对环境无污染，但目前市场上售卖肝素酶，价格昂贵，且均是肝素黄杆菌肝素酶。为了降低肝素酶的价格，可尝试以下三条途径：筛选新的高效产酶菌株 生化生化 方法方法 进一步研究肝素酶的结构、性质，提高分离纯化效率。LOGO Add your company slogan
