1、神经细胞(shn jn x bo)培养,第一页，共一百一十一页。,第一节：细胞培养的基本知识,1定义：组织培养(Tissue culture)：细胞培养(cell culture)：器官培养(piyng)(organ culture)：统称为体外培养（In vitro),第二页，共一百一十一页。,2 组织(zzh)或细胞培养的优点：,1）：研究对象是活细胞 2）：研究条件可以人为的控制3）：研究的样本可以达到比较均一性4）：研究的内容便于观察、检测和记录5）：研究的费用相对比较经济(jngj)6）：可作为一些遗传物质的运载细胞7)：干细胞的广泛应用前景,3 组织或细胞培养的不足：1）与体内条件
2、存在(cnzi)差异；2）细胞培养存在(cnzi)一定的不稳定性,第三页，共一百一十一页。,培养细胞学的研究(ynji)内容,1 培养细胞学在病毒学中的应用2 细胞生物学的基础研究:细胞培养使细胞生物学迅速发展3 细胞工程学的研究手段，利用细胞融合及杂交技术，进行细胞工程的研究与开发。4 干细胞的培养及应用5 淋巴细胞培养技术的应用6 遗传性疾病的产前检查7 细胞作为毒性实验及生物安全性实验的工具8 细胞培养在现代生物技术中应用很广，如基因分离，基因测序与表达，基因转移(zhuny)与重组，癌基因的研究等。,第四页，共一百一十一页。,4 培养细胞的特性 1）培养细胞生长方式(fngsh)：a
3、贴附生长型细胞（大多数）b 悬浮生长型细胞（少数）2）培养细胞生长特点：贴附；接触抑制；密度依赖性,第五页，共一百一十一页。,第六页，共一百一十一页。,第七页，共一百一十一页。,5 培养细胞生长的条件 1）细胞的营养需要：a 基本营养物质：氨基酸、维生素、碳水化合物及一些无机离子；b 营养因子等物质 2）细胞的生存环境：a 温度：哺乳动物(brdngw)和人类为3537；鸟类为38.5 b 气相及PH 值：O2及CO2的值：CO2=5%；PH=7.27.4 c 渗透压：260320m mol/L,第八页，共一百一十一页。,3)无污染及无毒：体外培养的细胞必须生长于无污染及无毒的环境！无毒：与细
4、胞直接接触者培养器皿、底物、培养基，蒸馏水等；间接接触者配制培养基的器皿、瓶盖、瓶塞等 无污染：微生物及交叉污染(wrn)，（霉菌污染(wrn)常见）,第九页，共一百一十一页。,6 常用(chn yn)的培养用液及培养基,培养用液：水平衡盐溶液（）（见表）作用：消化液胰蛋白酶液（%）二乙烯四乙酸(y sun)二钠（）胶原酶：甘氨酸 羟脯氨酸敏感培养基：1天然培养基（血清，血浆，组织浸出液，水解乳蛋白）2 合成培养基（S F12（）等,第十页，共一百一十一页。,常用(chn yn)的平衡盐溶液（g/L）,第十一页，共一百一十一页。,细胞(xbo)计数法：,原则(yunz)：取0.1 ml细胞悬液
5、 加 Hanks 液0.9ml，混匀后滴于血细胞计数板上，在低倍显微镜下计数四角大方格内细胞。计数过程中对于大方格边缘压线按照数上不数下，数左不数右的原则。细胞浓度=,4个大方格(fn)内细胞数,4,104 稀释倍数=细胞数/ml,第十二页，共一百一十一页。,细胞(xbo)活性的检查,台盼蓝染色：0.2 ml 细胞悬液加0.4 ml台盼蓝溶液混合，滴少许于载波片上，低倍镜计数200细胞，算比率，正常(zhngchng)不着色，死细胞为兰色,细胞活力（%）=（细胞总数(zngsh)-着色细胞数）/总细胞数100%,第十三页，共一百一十一页。,第 二节：神经细胞(shn jn x bo)体外培 养
6、的 基本概念和方案,神经细胞培养的类型 1 原代培养 原代培养（primary culture)：指从活体获得细胞、组织(zzh)或器官在体外条件下进行的第一次培养 传代培养(subculture)：当细胞持续生长到达一定密度之后，就应当将细胞分成两部分（或更多）至新的培养器皿并补充新的培养液为传代培养。2 细胞系培养,第十四页，共一百一十一页。,一 神经元的原代培养(piyng)(Primary culture),一、组织来源：1）种属：大鼠 小鼠 家鸡 瓜蟾 海兔 蜗牛 水蛭 等2）年龄：一般(ybn)为胚胎或新生动物组织神经胶质细胞：生后早期大部分神经元：胚胎末期颗粒细胞：生后两周以内主
7、要根据轴突和树突广泛分枝发育之前培养,第十五页，共一百一十一页。,二、常用试剂1）培养液 A DMEM：B F12 培养液 C DMEM/F12 培养液 D 无血清培养液加神经营养因子 E Neurobasal 培养液2）D-Hank液（其中可加入牛血清白蛋白3g/L）（HBSS）聚L-赖氨酸：处理培养皿（瓶）（10mg/L）5-10 min神经营养因子：睫状神经营养因子（ciliary neurotrophic factor,CNTF):支持交感神经、副交感神经和感觉神经的生长与存活；脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor,BDNF):支持外周
8、和中枢特殊细胞群体(qnt)的神经细胞；硷性成纤维生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF)等,第十六页，共一百一十一页。,三、培养操作过程 新生13d 大鼠或者胚胎18-19d大鼠，麻醉后75%酒精浸泡消毒，断头后移入超净工作台，无菌条件下开颅，快速取脑，置于D-Hanks液中，仔细剥除脑膜和血管，小心剥离脑组织（海马），放入10ml小瓶中剪碎，加入0.25%胰蛋白酶放入37培养箱，定期振摇促消化。消化约20min，用含血清的DMEM培养液终止消化，吸管反复轻柔吹打，用200目不锈钢筛网过滤，将滤液分散组成制成细胞悬液，1000rpm/min离心、洗细
9、胞两次，每次10min，吸收细胞悬液，用血球(xuqi)记数板快速计数细胞数，用含10%胎牛血清的DMEM培养基，稀释细胞制成一定浓度细胞悬液，接种于经多聚赖氨酸处理过的24孔培养板或培养瓶内（板孔放置0.80.8cm的小盖玻片），放入5%CO2培养箱，37培养。,第十七页，共一百一十一页。,四、神经元的鉴定：神经元特异性烯醇化酶（Neuron specific enolose NSE）、微管相关(xinggun)蛋白（Microtubule associated protein MAP2）神经元,五、神经元的纯化：胞嘧啶阿拉伯糖，培养2d 后用含510 mol/L 胞嘧啶阿拉伯糖的培养24
10、hour,然后改用常规培养液。特殊培养液：neurobasal 培养基,第十八页，共一百一十一页。,培养(piyng)过程中注意事项,1）培养底物的处理：多聚赖氨酸和多聚鸟氨酸、PEI 细胞外基质成分（胶原）细胞黏附分子 单层非神经细胞 单层的胶质细胞2）胰蛋白酶的作用时间(shjin)：3）细胞合适的换液时间：大脑皮质 不用经常换液 海马神经元应半量换液 胶质细胞经常换液,第十九页，共一百一十一页。,六、神经元的观察：刚分离出的神经元呈圆形，用倒置显微镜观察有明显的光晕。接种一般在2-6小时可贴壁；8小时已有纤细有突起长出24小时后可见(kjin)细胞体积开始增大，呈圆形或椭圆形。生长良好的
11、细胞可见(kjin)胞体周围有明显的光晕，立体感强，突起以单、双突起为主培养至第4天，神经元胞体明显增大，形态多样，有些具有分枝的突起，培养7天后，神经元形态基本成熟，具有光滑的胞体，发育良好的突起。,第二十页，共一百一十一页。,第二十一页，共一百一十一页。,第二十二页，共一百一十一页。,第二十三页，共一百一十一页。,MAP-2,第二十四页，共一百一十一页。,第二十五页，共一百一十一页。,第二十六页，共一百一十一页。,A,B,NSE stain neuron,TH stain neuron,第二十七页，共一百一十一页。,Confocal laserscan images of organtyp
12、ic slice culture from avian hippocampus,第二十八页，共一百一十一页。,Slice culture.Lucifer yellow stain(bar 50m),N,第二十九页，共一百一十一页。,运动神经元 Dil标记(bioj),第三十页，共一百一十一页。,Purkinje cell in culture(PEP-19),第三十一页，共一百一十一页。,第三十二页，共一百一十一页。,第三十三页，共一百一十一页。,第三十四页，共一百一十一页。,第三十五页，共一百一十一页。,第三十六页，共一百一十一页。,第三十七页，共一百一十一页。,第三十八页，共一百一十一页。
13、,第三十九页，共一百一十一页。,第四十页，共一百一十一页。,二、胶质细胞(xbo)的培养,第四十一页，共一百一十一页。,胶质细胞 纤维性 的分类(fn li)：a大胶质细胞 星形胶质细胞 原浆性 少突胶质细胞 b小胶质细胞周围神经系统主要是施万细胞,第四十二页，共一百一十一页。,根据免疫组化反应分类(fn li)：型星型胶质细胞和型星型胶质细胞：,第四十三页，共一百一十一页。,研究(ynji)胶质细胞的方法,1）从未成熟的脑组织分离、培养获得(hud)大量胶质细胞2）已经开发出能识别胶质细胞的免疫学标志物。,第四十四页，共一百一十一页。,利用细胞(xbo)培养可研究胶质细胞(xbo)的特性,受
14、体的表达：星型胶质细胞和少突胶质细胞可与传统的神经递质发生反映。（型胶质细胞可表达25种神经配体的受体神经营养因子的分泌：酶的诱导、蛋白质的合成神经递质的摄取髓鞘的形成神经的局部免疫(miny)反应代谢过程,第四十五页，共一百一十一页。,胶质细胞培养的局限性,1 大多来自于未成熟大脑，所以不能达到与体内相一致的成熟程度，即使成年也可能有干细胞的存在。其形态可能随培养条件而发生变化。存在不同(b tn)的细胞亚群 其性质有赖于他们与特殊神经元相互作用。,第四十六页，共一百一十一页。,培养(piyng)用液,培养基：MEM450ml+血清 45ml+GLU-谷氨酰胺 青链霉素溶液8ml葡萄糖-谷氨
15、酰胺 青链霉素溶液（100ml）：葡萄糖 30g；谷氨酰胺 100mmol/l；青霉素 2.5 105U;链霉素 2.510 g胰蛋白酶：0.25%少突胶质细胞的限定培养液：F12 与DMEM（高糖，4.5 g葡萄糖/L 1：1混合(hnh)后加入：BSA：终浓度为0.66 mg/ml,胰岛素:10ng/ml;孕酮:20 nmol/l;腐胺:100mol/l;碳酸氢钠:3.6 g/l;硒:5ng/ml;T3:30nmol/l;转铁蛋白:50 g/ml.,第四十七页，共一百一十一页。,培养的方法：1）取材 生后1天的大鼠，75%酒精消毒，断头，置于培养皿中 2）沿纵轴剪开皮肤和颅腔，取出大脑皮质
16、，去除嗅球等 3 去除脑膜，洗涤（Hanks液）4）组织剪成碎块，37缓慢振荡约10 min。5）胰蛋白酶(y dn bi mi)消化6)重复吹打，自然沉淀数次，收集细胞悬液,第四十八页，共一百一十一页。,（或者(huzh)6）移入试管吹打或加入胰蛋白酶形成单细胞悬液7）加入完全培养基终止8）调整细胞密度104106/cm2接种于培养瓶，常规CO2孵育箱培养9）接种3天后换液，以后每两天换液10）传代,0.25%胰蛋白酶消化（覆盖细胞层即可）或着用摇晃的方法,第四十九页，共一百一十一页。,传代时注意事项：a 细胞没有生长到足以(zy)覆盖瓶底壁大部分 表面以前，不要急于传代 b 注意观察不同细胞有不同的消化时间；动作要轻柔，避免损伤细胞 c 首次传代时细胞数量要多一些，使细胞尽快适应新环境鉴定：星形胶质细胞鉴定：胶质原纤维酸性蛋白（Glial fibrillary acid protein GFAP，A2B5）少突胶质细胞 鉴定：GalC（-galactosidase),第五十页，共一百一十一页。,神经胶质细胞分离和纯化(chn hu)流程,第0-12天 大鼠脑皮质(pzh)混合细胞培