1、PCRPCR技术在乙肝方面的应用技术在乙肝方面的应用 The application of PCR technique in HBVThe application of PCR technique in HBV 涿州市医院检验科 刘鹏年 Hepatitis B Virus 乙型肝炎的病原体乙型肝炎的病原体 在全世界广泛流行，估计全球半数以上人在全世界广泛流行，估计全球半数以上人口已被口已被HBVHBV感染过。感染过。中国：乙肝高发区，人群中国：乙肝高发区，人群HBsAgHBsAg的检出率的检出率达达9.8%9.8%乙型肝炎病毒感染的现状乙型肝炎病毒感染的现状 全球约有3.5亿人感染乙型肝炎病毒
2、，中国有1.2亿人感染，其中每年约有1-2%会出现肝硬化或肝癌而死亡。乙型肝炎是一种严重危害人类健康的传染病，它是由乙肝病毒(HBV)感染引起的。全世界乙肝携带者达5亿之多，我国是乙肝携带者高于人群的10。急性乙肝中有20%会转为慢性，进而可能发展为肝硬化和肝癌，因此，准确、迅速诊断对乙肝的治疗和预后显得极为重要。乙型肝炎病毒属嗜肝DNA病毒科（hepadnaviridae），基因组长度3.2kb 目前感染人类最小的DNA病毒 部分双链环状DNA。HBV基基 因因 及及 编编 码码 蛋蛋 白白 Hepatitis B Virus 乙肝的实验室诊断乙肝的实验室诊断 （一）生化学检查（一）生化学检
3、查 （二）（二）HBV血清学检查血清学检查 （三）（三）HBV DNA、基因型和变异检查、基因型和变异检查 生化学检查生化学检查 ALTALT和和ASTAST 血清胆红素血清胆红素 凝血酶原时间凝血酶原时间（PT）及及PTA 胆碱酯酶胆碱酯酶 血清白蛋白血清白蛋白 甲胎蛋白甲胎蛋白（AFP）生化检测的局限性生化检测的局限性 敏感度有限敏感度有限 代表肝细胞损害，水平高低不能代表肝储代表肝细胞损害，水平高低不能代表肝储备能力备能力 关于“胆酶分离”现象关于“胆酶分离”现象 HBV血清学检查血清学检查 项目：项目：HBsAg、抗、抗-HBs、HBeAg、抗、抗-HBe、抗、抗-HBc以及抗以及抗-
4、HBc IgM 方法方法 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay，最常用，定性，最常用，定性)发光免疫分析发光免疫分析(定量定量)HBsAg 感染的标志感染的标志 Anti-HBs 既往感染既往感染/接种疫苗接种疫苗 Anti-HBc IgM 急性感染标志急性感染标志 Anti-HBc IgG 既往或慢性感染既往或慢性感染 HBeAg 急性病毒复制急性病毒复制，有传染性有传染性 Anti-HBe 病毒不再复制病毒不再复制 HBV-DNA 急性病毒复制急性病毒复制，比比HBeAg更准更准确；主要用于监测治疗反应确；主要用于监测治疗反应 血清学检测的临床意义
5、 HBsAg 抗抗-HBs HBeAg 抗抗-HBe 抗抗-HBc 临床意义临床意义 急性或慢性感染急性或慢性感染(大三阳大三阳)+-+-+乙肝后期或慢性感染乙肝后期或慢性感染(小三阳小三阳)-+-潜伏期或急性乙肝早期潜伏期或急性乙肝早期-+痊愈或恢复期痊愈或恢复期,有免疫力有免疫力-+-痊愈痊愈,有免疫力有免疫力 疫苗接种或曾经感染过疫苗接种或曾经感染过,有免疫力有免疫力 血清学检测的局限性血清学检测的局限性 HBV具有“检测窗口期”具有“检测窗口期”假阴性结果假阴性结果 无法检测突变株及抗体无法检测突变株及抗体 Symptoms HBeAg anti-HBe IgG anti-HBc Ig
6、M anti-HBc anti-HBs HBsAg 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 52 100 Acute HBV Infection with Recovery Typical Serologic Course Weeks after Exposure Titre IgM anti-HBc IgG anti-HBc HBsAg Acute(6 months)HBeAg Chronic(Years)anti-HBe 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 52 Years Weeks after Exposure Titre Progression to
7、Chronic HBV Infection Typical Serologic Course PCR技术检测HBV DNA PCR 聚合酶链式反应聚合酶链式反应于于1983年由美国年由美国Cetus公司的公司的K.Mullis建立建立，并，并和定点突变的发明者和定点突变的发明者M.SmithM.Smith一起荣获一起荣获19931993年度诺贝尔化学奖，年度诺贝尔化学奖，为生命科学为生命科学领域的研究开创了崭新时代。领域的研究开创了崭新时代。PCR反应的特点 特异性强特异性强 引物与模板结合的特异性及聚合酶的忠实性引物与模板结合的特异性及聚合酶的忠实性 灵敏度高灵敏度高 指数增长指数增长，从从
8、pg(10-12)可扩增至可扩增至 m mg(10-6)水平水平 简便、快速简便、快速 2小时完成扩增小时完成扩增 对标本的纯度要求低对标本的纯度要求低 DNA 粗制品及总粗制品及总RNA均可作为扩增模板均可作为扩增模板 PCR反应过程 DNA的体外复制包括的体外复制包括3个步骤：个步骤：变性（变性（denaturation）:94 C 30s 退火（退火（annealing）:55 C 30s 延伸（延伸（extension）:72 C 30-60s 3个步骤作为个步骤作为PCR的一个循环，每当完成的一个循环，每当完成一个循环，一个分子的模板被复制为二个，一个循环，一个分子的模板被复制为二个
9、，产物量以指数形式增长。产物量以指数形式增长。普通普通PCRPCR技术的缺点技术的缺点 普通普通PCRPCR临床检测技术虽然解决了检出率低、周临床检测技术虽然解决了检出率低、周期长的问题，但由于假阳性率高，不能正确指期长的问题，但由于假阳性率高，不能正确指导临床实践。导临床实践。因此国家卫生部曾在因此国家卫生部曾在19971997年行文禁止将普通年行文禁止将普通PCRPCR技术用于临床诊断。技术用于临床诊断。定量定量PCR的特点的特点 采用闭管检测采用闭管检测，不需不需PCR后处理后处理，并采用并采用dUTP-UNG酶的防污染系统酶的防污染系统，扩增和检测一次扩增和检测一次同时完成同时完成。不
10、需开盖不需开盖，不产生污染不产生污染。避免了假避免了假阳性阳性。探针与被检探针与被检DNA序列特异杂交序列特异杂交，增强了特异性增强了特异性。定量定量PCR的特点的特点 可定量结果可定量结果，准确灵敏地反应了病原体的感准确灵敏地反应了病原体的感染和治疗恢复情况染和治疗恢复情况。光谱分析仪直读结果光谱分析仪直读结果，自动分析自动分析，增强了灵增强了灵敏性和客观性敏性和客观性。HBV DNA检测方法的比较 斑点杂交斑点杂交 PCRPCR 定量定量PCRPCR 敏感性敏感性 低低 较高较高 高高 特异性特异性 高高 稍低稍低 高高 重复性重复性 好好 稍差稍差 好好 定量范围定量范围 4 4 6 6
11、 6 6 简便简便 较繁琐较繁琐 简便简便 简便简便 安全性安全性 好好 稍差稍差 好好 设备设备 便宜便宜 稍贵稍贵 昂贵昂贵 技术要求技术要求 低低 高高 高高 检测价格检测价格 低低 中中 高高 为什么建议每个病人都要进行 HBV DNA检测？HBV DNA检测的临床意义 诊断方面：诊断方面：HBVHBV DNADNA是是HBVHBV存在最直接的依据存在最直接的依据 HBVHBV DNADNA是是HBVHBV复制的标志复制的标志 HBVHBV DNADNA是患者具有传染性的标志是患者具有传染性的标志 HBV DNA检测的临床意义 对对HBVHBV-M M起补充作用：起补充作用：HBeAg
12、(HBeAg()/)/抗抗HBe(HBe()乙型肝炎乙型肝炎 （前前C C区变异区变异）HBsAg(HBsAg()乙型肝炎乙型肝炎 （S S区变异区变异）低水平感染低水平感染 单项抗单项抗HBc(HBc()乙型肝炎乙型肝炎 HBV基基 因因 及及 编编 码码 蛋蛋 白白 HBV DNA检测的临床意义 疗效判断：疗效判断：HBVHBV DNADNA是目前判断乙肝抗病毒药是目前判断乙肝抗病毒药物疗效最敏感的指标物疗效最敏感的指标 预后判断预后判断 HBVHBV DNADNA水平与病情有一定的关系水平与病情有一定的关系 HBVHBV-M M与与HBV DNAHBV DNA关系关系 广东广东 四川四川
13、 湖南湖南 解放军解放军 南方医院南方医院 “大三阳大三阳”86.2 85.0 87.3 94.38 93.4“小三阳小三阳”35.1 20.3 25.6 27.3 23.8“小二阳小二阳”40.7 27.6 48.8 38.56 30.5 抗抗HBc 11.5 10.8 19.3 抗抗HBs 3.6 0 9.7 0 三抗体阳三抗体阳 5.0 1.1 10.0 全阴全阴 0 4.0 调查总例数调查总例数 1474 2828 814 838 773 HBV DNA阳性率阳性率 HBV DNA检测的临床意义 调查表明并不是所有调查表明并不是所有“大三阳大三阳”的的病人都处于病人都处于HBV复制期复
14、制期，具有传染性；具有传染性；也不是所有也不是所有“小三阳小三阳”的病人的病人HBV都都无复制无复制。因此因此，要准确知道要准确知道HBV是否是否处于复制状态处于复制状态，最准确的方法还是通最准确的方法还是通过检测过检测HBV DNA来决定来决定。HBVHBV-DNADNA定量检测的临床应用定量检测的临床应用 慢性乙肝诊断 治疗监测和疗效评价 跟踪随访 预后判断 HBVHBV-DNADNA定量定量 慢性乙肝的诊断慢性乙肝的诊断 HBsAg阳性六个月以上 ALT持续升高或反复升高 HBV-DNA大于105拷贝/毫升（HBeAg阳性）或104拷贝/毫升（HBeAg阴性）HBVHBV-DNADNA定
15、量定量 慢性乙肝的治疗监测慢性乙肝的治疗监测 治疗前检测患者的基线水平（ALT、HBV-DNA）治疗开始后前三个月每月一次、以后每三个月一次检测ALT、HBV-DNA，对于HBeAg阳性患者，还需检测HBeAg 如果治疗期间HBV-DNA水平降低两个数量级，可以认为治疗有效 HBVHBV-DNADNA定量定量 治疗后的随访治疗后的随访 无论有否治疗应答，都应对患者定期随访。建议停药后的前3个月每月1次、以后每36个月1次检测ALT、AST、HBV血清标志物和HBV DNA，以及临床表现和不良反应。随访至少6-12个月。如病情有变化，可随时随访。HBVHBV拉米夫定耐药拉米夫定耐药 虽然拉米夫定
16、治疗慢性乙肝疗效显著，但长期使用拉米夫定会出现耐药现象 使用一年、二年、三年、四年的耐药比率为：15-32%、38%、56%、67%一旦出现拉米夫定耐药突变（YMDD变异），大多数患者会在2-4个月之内出现HBV-DNA和ALT反弹 YMDDYMDD变异变异 YMDD 酪氨酸蛋氨酸天门冬氨酸天门冬氨酸。如发生YMDD变异，则其中的蛋氨酸（M）突变为异亮氨酸（isoleucine，I）或缬氨酸（valine，V）形成YIDD变异株或YVDD变异株。YMDD位于HBV多聚酶的关键功能区。YMDDYMDD变异检测变异检测 采用实时荧光定量PCR方法，不仅能够检测出现的突变类型（YVDD或YIDD），而且能够确定突变株所占比例，对及时调整治疗方案具有非常重要的意义 能够准确稳定的检测到1%的突变株，能够更早发现耐药突变，尽早调整治疗方案 HBV 拉米夫定耐药突变检测原理 Primer F Primer F Primer F Probe Probe Probe Primer HBV Primer YIDD Primer YVDD HBV检测检测 I突变检测突变检测 V突变检测突变检测 什么时候开
