1、第六章第六章 个别细胞和组织的培养个别细胞和组织的培养 类型：类型：正常细胞培养正常细胞培养 肿瘤细胞培养肿瘤细胞培养 第一节第一节 正常细胞培养正常细胞培养 正常细胞，在体外培养时都正常细胞，在体外培养时都不易生长，建不易生长，建立细胞系更难。立细胞系更难。正常细胞难培养的正常细胞难培养的原因是它们是分化的细原因是它们是分化的细胞，对体外生存条件要求严格胞，对体外生存条件要求严格.但只要一切条件适当仍有培养成功可能。但只要一切条件适当仍有培养成功可能。一、上皮细胞类培养一、上皮细胞类培养 上皮细胞可来源于外、内、中三个胚层；上皮细胞可来源于外、内、中三个胚层；培养中只有源于外和内胚层的细胞能
2、反映出上培养中只有源于外和内胚层的细胞能反映出上皮细胞的特征，细胞呈膜状生长的特点。皮细胞的特征，细胞呈膜状生长的特点。上皮细胞培养有三个难点：上皮细胞培养有三个难点：需求特殊底物，如在底物上涂有胶原底层则需求特殊底物，如在底物上涂有胶原底层则利于细胞生长；利于细胞生长；需求特殊培养基；需求特殊培养基；与上皮细胞相邻的成纤维细胞常与上皮细胞与上皮细胞相邻的成纤维细胞常与上皮细胞同时混杂生长，并常压过上皮细胞。同时混杂生长，并常压过上皮细胞。纯化和延长上皮细胞生存期纯化和延长上皮细胞生存期是上皮细胞培养是上皮细胞培养的关键之一。的关键之一。(一一)表皮细胞培养表皮细胞培养 1特点特点：在有胶原的
3、底物上易生长在有胶原的底物上易生长；把人或小鼠表皮细胞培养在以把人或小鼠表皮细胞培养在以3T3 细胞为饲养层细胞为饲养层(用射线照射用射线照射后后)上时，细胞易生长并可发生一定程度的分化现象。上时，细胞易生长并可发生一定程度的分化现象。降低降低pH、Ca2+的含量和温度等，均利于表皮细胞生长。的含量和温度等，均利于表皮细胞生长。向培养基中加氢化可的松向培养基中加氢化可的松(10 g/m1)、10-6M的异丙基肾上的异丙基肾上腺素腺素(Isoproterenol)和和10 ng/m1 促表皮生长因子促表皮生长因子(EGF)能能促表皮细胞生长。促表皮细胞生长。【饲细胞饲细胞】饲细胞饲细胞(Feed
4、er Cells)也称滋养也称滋养细胞，是一层经过射线照射或丝裂霉素伤害处理细胞，是一层经过射线照射或丝裂霉素伤害处理的、用作克隆细胞附着底物的细胞层。的、用作克隆细胞附着底物的细胞层。饲细胞作用：饲细胞作用：有同化营养液的能力有同化营养液的能力。饲细胞能促克隆细胞的生长，利于克隆的形成饲细胞能促克隆细胞的生长，利于克隆的形成。克隆形成后饲细胞渐死亡，换液时清除。克隆形成后饲细胞渐死亡，换液时清除。饲细胞的制备：饲细胞的制备：(1)取原代培养的取原代培养的人或动物胚胎成纤维细胞人或动物胚胎成纤维细胞，90%汇合时制成细胞悬液，再按汇合时制成细胞悬液，再按103 细胞细胞/毫升重新接毫升重新接种
5、培养；种培养；(2)在细胞半汇合时，准备在细胞半汇合时，准备0.25g/ml 的丝裂霉素，的丝裂霉素，按按2ug/105 细胞的量加入到培养瓶中过夜；或用细胞的量加入到培养瓶中过夜；或用射线单次照射，剂量射线单次照射，剂量3050 戈瑞戈瑞(Gy)；(3)细胞经上述处理后，细胞经上述处理后，Hanks 液漂洗两次、更换液漂洗两次、更换培养液、再培养培养液、再培养24 小时，胰蛋白酶消化细胞制成小时，胰蛋白酶消化细胞制成悬液，按悬液，按5104/ml接种入新培养基中；接种入新培养基中；(4)48 小时后，即可用于细胞克隆之用。小时后，即可用于细胞克隆之用。2表皮细胞培养程序：表皮细胞培养程序：(
6、1)取材取材：取外科植皮或手术残余皮肤小块，以角化层薄者为佳，：取外科植皮或手术残余皮肤小块，以角化层薄者为佳，早产流产儿皮肤更好，切成早产流产儿皮肤更好，切成0.5 1cm2小块；小块；(2)EDTA 处理处理：先置入：先置入0.02 EDTA 中室温置中室温置5 分钟。分钟。(3)冷消化冷消化：换入：换入0.25%胰蛋白酶中，置胰蛋白酶中，置4过夜；过夜；(4)分离：分离：取出皮块，用血管钳或镊子把表皮与真皮层分开；取出皮块，用血管钳或镊子把表皮与真皮层分开；(5)温消化：温消化：取出表皮单独处理；用剪刀剪成更小的块后，取出表皮单独处理；用剪刀剪成更小的块后，置入新的置入新的0.25胰蛋白
7、酶中，胰蛋白酶中，37再消化再消化30 60 分钟；分钟；(6)制细胞悬液：制细胞悬液：用吸管轻轻反复吹打，使成细胞悬液；用吸管轻轻反复吹打，使成细胞悬液；(7)加培养液：加培养液：通过通过80 目不锈钢纱网滤过后，低速离心，吸目不锈钢纱网滤过后，低速离心，吸上清，直接加入上清，直接加入Eagle 液和液和20小牛血清小牛血清.(8)培养：培养：接种入碟皿中，接种入碟皿中，CO2 温箱培养。温箱培养。注意事项：注意事项：冷消化目的在于使表皮和真皮结合冷消化目的在于使表皮和真皮结合松散；松散；如冷消化后分离下来的表皮膜自身也已如冷消化后分离下来的表皮膜自身也已松散，此时亦可直接置入松散，此时亦可
8、直接置入PBS 中用吸管吹打中用吸管吹打制备细胞悬液；不再经过第二次消化。制备细胞悬液；不再经过第二次消化。(二二)胃上皮细胞培养胃上皮细胞培养 适于胃上皮细胞生长的条件是：适于胃上皮细胞生长的条件是：胶原酶和透明质酸酶消化法并用消化细胞；胶原酶和透明质酸酶消化法并用消化细胞；应用胶原底物培养；应用胶原底物培养；制备含有特定成分的培养基；制备含有特定成分的培养基；培养程序：培养程序：(1)取材取材：取胃溃疡或胃癌手术切除胃标本远端：取胃溃疡或胃癌手术切除胃标本远端非病非病变区变区粘膜少许；粘膜少许；(2)清洗清洗：用含庆大霉素：用含庆大霉素(400g/m1)和两性霉素和两性霉素(2g/m1 的
9、的Hanks)液漂洗后，用钝器剥离下粘膜，液漂洗后，用钝器剥离下粘膜，剪成剪成1mm大小；大小；(3)消化消化：在：在I 型胶原酶型胶原酶和和透明质酸酶透明质酸酶中，于中，于37中消中消化化80 分钟；分钟；(4)离心离心：收集细胞悬液，：收集细胞悬液，800 转转/分离心后，分离心后，Hanks 液漂洗两次；液漂洗两次；(5)接种接种：末次离心后加入含有：末次离心后加入含有1 2胎牛胎牛血清的完全培养基血清的完全培养基，接种入不同孔数的培养，接种入不同孔数的培养板中；接种量依不同实验目的而定。板中；接种量依不同实验目的而定。细胞接种后一般在细胞接种后一般在16 小时内贴壁，细胞呈小时内贴壁，
10、细胞呈多角形，成岛状或片状生长，以后逐渐联接多角形，成岛状或片状生长，以后逐渐联接成片。初代培养可维持成片。初代培养可维持2 3 周，第一周末周，第一周末达高峰，最后逐渐衰退剥落。达高峰，最后逐渐衰退剥落。(三三)肝细胞培养肝细胞培养 肝脏具有取材方便和易于生长的优点，能获肝脏具有取材方便和易于生长的优点，能获得典型上皮细胞培养。得典型上皮细胞培养。1初代组织块培养：初代组织块培养：肝组织做组织块培养效果很好。取新鲜肝脏，肝组织做组织块培养效果很好。取新鲜肝脏，先剥除被膜和血管等纤维成分，用刀或剪刀先剥除被膜和血管等纤维成分，用刀或剪刀把肝剪成把肝剪成1mm3 左右的小块，采用贴壁培养左右的小
11、块，采用贴壁培养法。肝组织易于贴壁，生长力好，一般次日法。肝组织易于贴壁，生长力好，一般次日即可出现生长晕。即可出现生长晕。2初代消化法培养：初代消化法培养：(1)把肝组织切成把肝组织切成2 4 立方毫米的小块，用不合钙镁立方毫米的小块，用不合钙镁的的BSS 液洗两次；液洗两次；(2)移入移入1:1 的的0.1胰蛋白酶和胰蛋白酶和0.1胶原酶胶原酶(都用无钙都用无钙镁镁BSS 配制配制)中，中，4冷消化冷消化10 12 小时后，通过小时后，通过250 微米和微米和64 微米尼龙网或不锈钢纱网滤过微米尼龙网或不锈钢纱网滤过(用纱布用纱布滤过亦可滤过亦可)；(3)收集细胞、收集细胞、BSS 液洗液
12、洗1 2 次、计数、接种培养；次、计数、接种培养；3肝脏灌流法：肝脏灌流法：需用全肝，以较小动物如小鼠和大鼠为好需用全肝，以较小动物如小鼠和大鼠为好。(1)无菌解剖动物，取出肝脏，先用无菌解剖动物，取出肝脏，先用BSS 洗除血污；洗除血污；(2)取取5ml 注射器一支，吸取消化液后，把注射器一支，吸取消化液后，把注射器头轻轻插入肝注射器头轻轻插入肝管中管中，用线绳结扎牢固，以防消化液漏出，轻轻把消化液注，用线绳结扎牢固，以防消化液漏出，轻轻把消化液注入胆管系统，并不时轻柔压肝脏，以便消化液进入肝小叶中；入胆管系统，并不时轻柔压肝脏，以便消化液进入肝小叶中；消化液在肝内停留消化液在肝内停留20
13、30 分后，在吸出消化液的同时并轻柔分后，在吸出消化液的同时并轻柔压肝脏，以使肝细胞脱落和消化液吸出；压肝脏，以使肝细胞脱落和消化液吸出；(3)待吸净消化液后，注入离心管中，低待吸净消化液后，注入离心管中，低速离心分离，用速离心分离，用RPMI 1640 培养基培培养基培养养(较其它培养基为好较其它培养基为好)，能获得较纯的，能获得较纯的肝上皮细胞和获较好的效果。肝上皮细胞和获较好的效果。(四四)内皮细胞培养内皮细胞培养 应用材料：应用材料：人脐带脐静脉、动物大动脉等，人脐带脐静脉、动物大动脉等，用灌流消化法获取细胞最为简便。用灌流消化法获取细胞最为简便。(1)取产后的新鲜脐带；如不立即培养可
14、保存取产后的新鲜脐带；如不立即培养可保存于于4中，但不宜超过中，但不宜超过12 小时；小时；无菌剪取无菌剪取长长10 15 厘米一段厘米一段。其它如胚胎和幼体动物的大血管，亦可用其它如胚胎和幼体动物的大血管，亦可用于培养；于培养；(2)先用三通注射器吸先用三通注射器吸温温PBS 液注入脐带的脐液注入脐带的脐静脉中，洗除残血静脉中，洗除残血；注入口处宜用线绳结；注入口处宜用线绳结扎，以防液体返流；扎，以防液体返流；(3)用血管钳夹紧脐带一端，从另端向脐静脉中用血管钳夹紧脐带一端，从另端向脐静脉中徐徐注入最终浓度为徐徐注入最终浓度为0.1的胶原酶的胶原酶，待末端，待末端出现液体后结扎之，令充满血管
15、，注入口亦出现液体后结扎之，令充满血管，注入口亦应结扎，以防液体返流，应结扎，以防液体返流，消化消化3 10 分钟分钟；(4)吸出含有内皮细胞的消化液，注入离心管中吸出含有内皮细胞的消化液，注入离心管中；为获取更多细胞，可再注入温为获取更多细胞，可再注入温PBS 冲洗冲洗2 3 次彻底清除干净残余细胞，一并注入离心管次彻底清除干净残余细胞，一并注入离心管中离心；中离心；(5)吸除上清，加吸除上清，加1640 培养液，制成细胞悬液，培养液，制成细胞悬液，接种入瓶皿中培养接种入瓶皿中培养，顺利时，顺利时2 3 天内细胞即天内细胞即可长成单层。可长成单层。人脐带易于获得，培养效果好；细胞生长后，人脐
16、带易于获得，培养效果好；细胞生长后，一般传一般传6 7 代后即衰退，难以长期维持。代后即衰退，难以长期维持。用兔血管内皮细胞培养较好，可传用兔血管内皮细胞培养较好，可传10 30 代；代；不同部位血管内皮细胞生物学性状不同，对不同部位血管内皮细胞生物学性状不同，对各种作用因素反应亦有很大差别。各种作用因素反应亦有很大差别。(五五)毛细血管内皮细胞培养毛细血管内皮细胞培养 毛细血管细小，结构简单，内皮细胞外有较毛细血管细小，结构简单，内皮细胞外有较多的结缔组织，进行分离培养有很大困难。多的结缔组织，进行分离培养有很大困难。近年毛细血管培养已获成功；近年毛细血管培养已获成功；利用人的小儿包皮、人脾脏、牛肾上腺、癌利用人的小儿包皮、人脾脏、牛肾上腺、癌组织组织(如卵巢癌如卵巢癌)等均可；等均可；1材料：材料：肿瘤条件培养基制备肿瘤条件培养基制备(1)取取C3H 小鼠的小鼠的S-180 实体肉瘤组织实体肉瘤组织；(2)胰蛋白酶消化胰蛋白酶消化，Dulbecco 改良改良Eagle 氏氏培养液培养液15m1(含含10小牛血清小牛血清)种到培养种到培养瓶中培养；瓶中培养；(3)在细胞生长接近完全汇
