1、实验三 常用培养基的制备、灭菌与消毒 实验目的：实验目的：1 1.了解培养基的配制原理了解培养基的配制原理 2 2.掌握配制培养基的一般方法和步骤掌握配制培养基的一般方法和步骤 培养基是人工配制的培养基是人工配制的，适合微生物生长繁殖或产生代谢产物适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的营养基质的营养基质 原则：目的明确原则：目的明确 ;营养协调营养协调;控制控制PHPH、渗透压等条件渗透压等条件;经济节经济节约约 方法：查阅文献方法：查阅文献;精心设计精心设计;试验比较试验比较 步骤：称量步骤：称量、熔化熔化、调调PHPH、过滤过滤、分装分装、加塞加塞、包扎包扎、灭菌灭菌、冷却冷却、无菌检查无菌检
2、查 培养基种类培养基种类:碳源碳源、氮源氮源、能源能源、生长因子生长因子、无机盐无机盐、水水 一一、按成份的不同划分按成份的不同划分 天然培养基天然培养基、合成培养基合成培养基、半合成培养基半合成培养基 二二、按培养基的物理状态划分按培养基的物理状态划分 固体培养基固体培养基、液体培养基液体培养基、半固体培养基半固体培养基 三三、按培养基用途划分按培养基用途划分 基础培养基基础培养基、加富培养基加富培养基、鉴别培养基鉴别培养基、选择培选择培养基养基 牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基 牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。其配方如下：
3、最普通的细菌基础培养基。其配方如下：牛肉膏牛肉膏3g3g，蛋白胨，蛋白胨10g10g，Nacl5gNacl5g，琼脂，琼脂151520g20g，水，水1000mL1000mL，PH7.0PH7.07.2(7.2(后调后调)高氏高氏1 1号培养基号培养基 高氏高氏1 1号培养基是用于分离和培养放线菌的号培养基是用于分离和培养放线菌的合成培养基。其配方如下：合成培养基。其配方如下：可溶性淀粉可溶性淀粉20g20g，KNO3 1gKNO3 1g，NaCl 0.5gNaCl 0.5g，K2HPO4K2HPO4 3H2O 0.5g3H2O 0.5g，MgSO4MgSO4 7H2O 0.5g7H2O 0.
4、5g，FeSO4FeSO4 7H2O 0.01g7H2O 0.01g，琼脂，琼脂151520g20g，水，水1000mL1000mL，pH7.4pH7.47.67.6。查氏合成培养基查氏合成培养基 查氏合成培养基是用来分类和培养霉菌的查氏合成培养基是用来分类和培养霉菌的培养基培养基,其配方如下：其配方如下：NaNO3 3g,K2HPO4 1g,KCl 0.5g,NaNO3 3g,K2HPO4 1g,KCl 0.5g,MgSO4.7H2O 0.5g,FeSO4 0.01g,MgSO4.7H2O 0.5g,FeSO4 0.01g,蔗糖蔗糖 30g,30g,H2O 1000ml,pHH2O 1000
5、ml,pH自然自然 麦芽汁培养基麦芽汁培养基 用来培养酵母菌用来培养酵母菌,干麦芽粉加干麦芽粉加4 4倍水倍水,在在5050-6060保温糖化保温糖化3 3-4 4小时，用碘液试验检查至小时，用碘液试验检查至糖化完全为止糖化完全为止,调整糖液浓度调整糖液浓度,煮沸后，过煮沸后，过滤，调滤，调pHpH为为6.06.0。消毒与灭菌消毒与灭菌 消毒：消灭病原菌和有害微生物的营养体消毒：消灭病原菌和有害微生物的营养体 灭菌：杀灭一切微生物的营养体灭菌：杀灭一切微生物的营养体，芽胞和孢子芽胞和孢子。方法：方法：物理的方法：加热、过滤、辐射物理的方法：加热、过滤、辐射 化学的方法：用化学试剂抑制或杀灭微生
6、物。主要破化学的方法：用化学试剂抑制或杀灭微生物。主要破坏细菌代谢机能。如重金属离子，磺胺类药物及抗坏细菌代谢机能。如重金属离子，磺胺类药物及抗生素等生素等。加热法：加热法：干热法：火焰灼烧灭菌和热空气灭菌干热法：火焰灼烧灭菌和热空气灭菌 1 1、火焰灼烧适用于接种环、接种针和金属用具如镊子等，试管、火焰灼烧适用于接种环、接种针和金属用具如镊子等，试管口和瓶口，涂布用玻璃棒。口和瓶口，涂布用玻璃棒。2 2、热空气灭菌利用高温干燥空气（、热空气灭菌利用高温干燥空气（160160170C170C）加热灭菌）加热灭菌1 12h2h，适用于玻璃器皿和培养皿等。原理加热使蛋白质变性，与水适用于玻璃器皿和
7、培养皿等。原理加热使蛋白质变性，与水的含量有关，当环境和细胞含水量越大，凝固越快。的含量有关，当环境和细胞含水量越大，凝固越快。3 3、注意事项：、注意事项：1 1）培养基、橡胶制品、塑料制品不能用此法；）培养基、橡胶制品、塑料制品不能用此法；2 2）温度控制在）温度控制在180180；3 3）物品不能太挤；）物品不能太挤；4 4）温度降至）温度降至7070时才开箱门。时才开箱门。湿热法湿热法 ：原理：因为湿热中菌体吸水，蛋白质容易凝固，原理：因为湿热中菌体吸水，蛋白质容易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低；因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低；湿热的蒸气有潜热存在。所以效果比同温度湿
8、热的蒸气有潜热存在。所以效果比同温度下干热好。下干热好。高压蒸汽灭菌法：高压蒸汽灭菌法：1 1、设备：高压灭菌锅、设备：高压灭菌锅 2 2、时间长短根据灭菌物品的种类和数量不同有、时间长短根据灭菌物品的种类和数量不同有所变化。所变化。3 3、适用于培养基、工作服、橡胶物品等的灭菌，、适用于培养基、工作服、橡胶物品等的灭菌，也可用于玻璃器皿的灭菌。也可用于玻璃器皿的灭菌。4 4、注意事项：、注意事项：1 1）冷空气彻底排除；）冷空气彻底排除；2 2）加水；）加水；3 3）压力降为）压力降为“0 0”时方可打开时方可打开。在使用高压蒸气灭菌锅灭菌时，灭菌锅内在使用高压蒸气灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空
9、气的排除是否完全极为重要，因为空冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸气的膨胀压，所以，气的膨胀压大于水蒸气的膨胀压，所以，当水蒸气中含有空气时，在同一压力下，当水蒸气中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸气的温度低于饱和蒸气的温度。含空气蒸气的温度低于饱和蒸气的温度。灭菌锅内留有不同分量空气时，压力与温灭菌锅内留有不同分量空气时，压力与温度的关系见度的关系见表表2 常压蒸汽灭菌：常压蒸汽灭菌：对于不宜用高压蒸汽灭菌的培养基如明胶培养基对于不宜用高压蒸汽灭菌的培养基如明胶培养基、牛牛乳培养基乳培养基，含糖培养基等可采用此法含糖培养基等可采用此法。彻底灭菌则采彻底灭菌则采用间歇灭菌
10、方法用间歇灭菌方法。煮沸灭菌法：煮沸灭菌法：适用注射器和解剖器皿适用注射器和解剖器皿，时间时间10101515minmin，超高温杀菌超高温杀菌 135135-150150C C和和2 2-8s8s对牛乳和其它液态食品灭菌。对牛乳和其它液态食品灭菌。优点优点 ：保持食品价值和营养成分。保持食品价值和营养成分。过滤除菌：过滤除菌：原理：介质在有压力时阻隔微生物。原理：介质在有压力时阻隔微生物。适用范围：许多材料如血清、抗生素及糖溶液采用此法。适用范围：许多材料如血清、抗生素及糖溶液采用此法。设备：蔡氏过滤器，滤膜过滤器。设备：蔡氏过滤器，滤膜过滤器。优缺点：不破坏培养基成分，只适用少量滤液。优缺
11、点：不破坏培养基成分，只适用少量滤液。注意事项：注意事项：1 1、压力适当；、压力适当；2 2、无菌条件下进行；、无菌条件下进行；3 3、防止渗透现象。、防止渗透现象。辐射灭菌：辐射灭菌：原理：原理：紫外线波长在紫外线波长在200200300nm300nm，具有杀菌作用，以，具有杀菌作用，以265265-266266杀菌力强。此段波长易被细胞中核酸吸收；可杀菌力强。此段波长易被细胞中核酸吸收；可产生臭氧和过氧化氢。杀菌效力与强度和时间的乘积成产生臭氧和过氧化氢。杀菌效力与强度和时间的乘积成正比。正比。缺点：缺点：穿透力不大。距照射物穿透力不大。距照射物1.2m1.2m为宜。为宜。应用：应用：无
12、菌室，医院。无菌室，医院。注意事项：注意事项：对眼睛和皮肤有刺激作用。对眼睛和皮肤有刺激作用。化学药品灭菌：化学药品灭菌：原理：原理：应用化学制剂破坏细菌代谢机能。应用化学制剂破坏细菌代谢机能。杀菌剂如重金属离子；杀菌剂如重金属离子；抑菌剂如磺胺类及多数抗生素。抑菌剂如磺胺类及多数抗生素。注意：注意：与药品的浓度高低，时间长短，微生物种类与药品的浓度高低，时间长短，微生物种类以及微以及微 生物所处的环境有关。生物所处的环境有关。常用化学杀菌剂有：常用化学杀菌剂有：乙醇、醋酸、石碳酸乙醇、醋酸、石碳酸 福尔马林、升汞、高锰酸钾、新洁尔灭等福尔马林、升汞、高锰酸钾、新洁尔灭等 分离与纯化：从混杂的
13、微生物群体中获得只含分离与纯化：从混杂的微生物群体中获得只含某一种某一种 或某一株微生物的过程或某一株微生物的过程。为什么要进行纯培养：平板上的单一菌落并不为什么要进行纯培养：平板上的单一菌落并不一定保一定保 证是一种菌证是一种菌。常用的分离常用的分离、纯化方法：纯化方法：单细胞挑取法单细胞挑取法、稀释涂布平板法稀释涂布平板法 稀释混合平板法、平板划线法稀释混合平板法、平板划线法 实验四实验四 微生物的分离、纯化及培微生物的分离、纯化及培养技术养技术 稀释涂布平板法稀释涂布平板法 ：步骤：步骤：1 1、倒平板：牛肉膏蛋白胨培养基倒平板：牛肉膏蛋白胨培养基，高氏高氏I I号培养基号培养基，查查氏
14、培养基冷却至氏培养基冷却至5555-6060时时，混匀后倒平板混匀后倒平板，牛肉膏蛋白胨培牛肉膏蛋白胨培养基倒养基倒4 4皿皿，高氏高氏I I号培养基和查氏培养基各倒号培养基和查氏培养基各倒3 3皿皿。2 2、制备污水稀释液：制备污水稀释液：1010g g土样土样，加入加入9090mlml无菌水中无菌水中，在在三角瓶中振摇三角瓶中振摇2020minmin。取取0 0.5 5mlml 加入盛有加入盛有4 4.5 5mlml无菌水的试管中无菌水的试管中，以此类推以此类推，制成不同稀释度制成不同稀释度。3 3、涂布：将上述每种培养基平板底面标记稀释度涂布：将上述每种培养基平板底面标记稀释度，然后然后
15、用无菌吸管从最后三种稀释度用无菌吸管从最后三种稀释度，即即1010-4 4、1010-5 5和和1010-6 6的试管中吸的试管中吸取取0 0.1 1mlml对号放入平板上对号放入平板上，用玻棒涂布用玻棒涂布。4 4、培养：高氏培养：高氏I I号和查氏倒置培养于号和查氏倒置培养于2828培养箱中培养培养箱中培养3 3-5 5daysdays，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基在3737培养培养1 1-2 2daysdays。5 5、挑菌落：转至斜面，检查是否一致，保存。、挑菌落：转至斜面，检查是否一致，保存。平板划线法：平板划线法：1 1、倒平板倒平板，标记培养基名称标记培养基名称
16、，编号和实编号和实验日期验日期。2 2、划线方法、划线方法 稀释混合平板法稀释混合平板法 ：1 1、先加菌、先加菌 2 2、倒平板时注意培养基温度、倒平板时注意培养基温度 3 3、混合均匀、混合均匀 微生物培养技术微生物培养技术 1 1、斜面接种、斜面接种 2 2、液体培养基接种、液体培养基接种 3 3、穿刺接种、穿刺接种 将已接种的斜面、半固体和液体培养基放置将已接种的斜面、半固体和液体培养基放置培养箱培养箱 中培养将生长好的菌种用牛皮纸包好，置中培养将生长好的菌种用牛皮纸包好，置44冰箱中冰箱中 保存。保存。观察菌落形态并记录观察菌落形态并记录 序号序号 来源来源 大小大小 形状形状 边缘边缘 颜色颜色 表面表面 代谢物代谢物 种类种类 实验五：放线菌及霉菌形态观察 目的要求目的要求 1.1.了解放线菌、霉菌的形态观察的原理。了解放线菌、霉菌的形态观察的原理。2.2.学习并掌握观察放线菌、霉菌形态的操学习并掌握观察放线菌、霉菌形态的操作方法。作方法。3.3.初步了解放线菌、霉菌的形态特征。初步了解放线菌、霉菌的形态特征。原理原理 放线菌是一群丝状，放线菌是一群丝状，G G+的细菌，
