1、33(1):68Feb.,2023生物技术Biotechnology第 33 卷第 1 期2023 年 2 月 收稿日期:2022-09-16 作者简介:陈宇(1981-),男,湖北省丹江口人,硕士,主治医师,研究方向:肿瘤微创及分子靶向治疗,发表论文 20 余篇,其中 SCI 1 篇,出版专著 1 部,申请专利 3 件,E-mail:myth 。通讯作者:袁丽(1979-),女,湖北省黄陂人,学士,实验师,研究方向:妇科肿瘤,发表论文 10 篇,其中 SCI 1 篇,申请专利 3 件,E-mail:。LncRNA MIR4435-2HG 靶向 TGF-1 对 NSCLC 细胞的影响陈宇1,袁
2、丽2(1.十堰市太和医院/湖北医药学院附属医院肿瘤科,湖北 十堰 442000;2.湖北医药学院第一临床学院,湖北 十堰 442000)摘要:目的 探讨长链非编码 RNA MIR4435-2HG(LncRNA MIR4435-2HG)靶向上调转化生长因子-1(TGF-1)对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞迁移、增殖的作用及其初步机制。方法 检测 NSCLC 癌组织及其癌旁组织、NSCLC 细胞株及正常人支气管上皮细胞(HBE)中 MIR4435-2HG 和 TGF-1 表达。将 pcDNA-MIR4435-2HG 和 pcDNA 质粒转染至 A549 细胞,CCK-8 法、Transwell 法
3、检测细胞增殖、迁移能力。Western Blot 法检测细胞 TGF-1 表达。免疫共沉淀验证 MIR4435-2HG 与 TGF-1 靶向作用。结果NSCLC 组织 MIR4435-2HG(1.89 0.52 vs 0.76 0.48)和TGF-1 相对表达量(1.43 0.22 vs 0.37 0.18)均高于癌旁组织(P 0.05);与 HBE 细胞比较,NSCLC 细胞株MIR4435-2HG 相对表达量升高(P 0.05),且其中 A549 细胞高于 H226 细胞(P 0.05);与阴性对照组比较,MIR4435-2HG 过表达组细胞 MIR4435-2HG(4.72 0.43 v
4、s 3.38 0.46)及 TGF-1(0.82 0.13 vs 1.07 0.24)相对表达量、细胞 48 h OD 值(0.43 0.03 vs 0.52 0.04)及迁移数量(89.63 18.28)个 vs(169.89 20.34)个均增加(P 0.05)。结论 NSCLC 组织中 MIR4435-2HG 呈高表达,LncRNA MIR4435-2HG 可能通过靶向上调 TGF-1 促进 NSCLC 细胞迁移和增殖。关键词:非小细胞肺癌;LncRNA MIR4435-2HG;转化生长因子-1;迁移;增殖;生物学行为;靶向调节中图分类号:R734.2 文献标识码:A DOI:10.16
5、519/ki.1004-311x.2023.01.0011Effects of LncRNA MIR4435-2HG targeting TGF-1 on thebiological behavior of non-small cell lung cancer cellsCHEN Yu1,YUAN Li2(1.Department of Oncology,Taihe Hospital/Affiliated Hospital of Hubei Univesity of Medicine,Shiyan 442000,China;2.The First Clinical College,Hubei
6、University of Medicine,Shiyan 442000,China)Abstract:Objective To investigate the effect and its mechanism of long-chain non-coding RNA MIR4435-2HG(Ln-cRNA MIR4435-2HG)-mediated upregulation of transforming growth factor-1(TGF-1)on the migration and prolifera-tion of non-small cell lung cancer(NSCLC)
7、cells.MethodMIR4435-2HG and TGF-1 expression were detected inNSCLC cancer tissues and their tissues,NSCLC cell lines and normal human bronchial epithelial cells(HBE).PcDNA-MIR4435-2HG and pcDNA plasmids were transfected into A549 cells,and cell proliferation and migration were measured byCCK-8 assay
8、 and transwell assay.TGF-1 expression in cells was detected by Western Blot.Co-immunoprecipitation wasperformed to verify MIR4435-2HG targeting with TGF-1.Result The relative expression levels of MIR4435-2HG(1.890.52 vs 0.76 0.48)and TGF-1(1.43 0.22 vs 0.37 0.18)in NSCLC tissues were higher than tho
9、se in paracancer-ous tissues(P 0.05).Compared with HBE cells,the relative expression levels of MIR4435-2HG in NSCLC cell lines wereincreased(P 0.05),and A549 cells were higher than H226 cells(P 0.05).Compared with the negative control group,therelative expression levels of MIR4435-2HG(4.72 0.43 vs 3
10、.38 0.46)and TGF-1(0.82 0.13 vs 1.07 0.24),ODvalue at 48 hours(0.43 0.03 vs 0.52 0.04)and migration number(89.63 18.28)vs(169.89 20.34)in theMIR4435-2HG overexpression group were increased(P 0.05).ConclusionMIR4435-2HG showed highexpression in NSCLC tissues,and lncRNA MIR4435-2HG may promote NSCLC c
11、ell migration and proliferation by targeted up-regulation of TGF-1.Keywords:non-small cell lung cancer;LncRNA MIR4435-2HG;transforming growth factor-1;migration;proliferation;1 期陈宇,等:LncRNA MIR4435-2HG 靶向 TGF-1 对 NSCLC 细胞的影响biological behavior;targeted regulation长链非编码 RNA(Long non coding RNA,Ln-cRNA
12、)是一类长度大于 200nt 的非编码 RNA 分子1。近年研究表明,某些异常表达的 LncRNA 在非小细胞肺癌(Non small cell lung cancer,NSCLC)发生发展中发挥重要作用,不仅可提高诊断 NSCLC 敏感度和特异度,还可通过以质粒为基础的靶向治疗等针对 LncRNA 治疗改善患者预后2-3。LncRNAMIR4435-2HG 被多项研究证实参与了肺癌、胃癌等恶性肿瘤细胞的生物学行为调节过程。转化生长因子-1(Transforming growth factor-1,TGF-1)是细胞多种生命活动的重要调节因子。研究表明,TGF-1 在包括肺癌在内的多种肿瘤组织
13、中表达上调,并可通过促进肿瘤细胞迁移和增殖,参与癌症发生和发展4。既往研究发现,在多种恶性肿瘤疾病中,TGF-1 可被 LncRNA 调控5。另有研究发现,LncRNA MIR4435-2HG 可通过调控 -连环蛋白通路促进肺癌发生和发展6,而 TGF-1 为-连环蛋白通路下游重要调控因子之一,但 Ln-cRNA MIR4435-2HG 是否通过靶向上调 TGF-1影响 NSCLC 细胞生物学行为尚不明确7。本研究就此进行分析并报道如下。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验材料选择 2019 年 9 月-2020 年 9 月接受手术治疗的113 例 NSCLC 患者,收集 NSCLC 癌
14、组织及其癌旁组织(距癌组织至少 5 cm)。所有患者术前均未接受放化疗等抗肿瘤治疗,其中男性 60 例、女性 53例,年龄 31 80 岁,平均年龄为(58.93 10.15)岁;病理组织类型,鳞癌 54 例、腺癌 39 例、腺鳞癌 20例。研究经医院伦理委员会批准,患者均签署知情同意书。正常人支气管上皮细胞(HBE)、人肺鳞癌细胞(H226)、人肺腺癌细胞(A549)均购自宁波明舟生物科技有限公司。1.1.2 试剂A549/Tax 细胞专用培养基、PBS 缓冲液、胰蛋白酶,宁波明舟生物科技有限公司;Lipofectamine2000 试剂,深圳子科生物科技有限公司;总 RNA 提取试剂盒、反
15、转录试剂盒、CCK-8 试剂盒、RIPA 裂解液、BCA 蛋白浓度测定试剂盒、膜封闭液、ECL 试剂盒,北京百奥莱博生物科技有限公司;SYBRPremix Ex Taq 试剂盒,大连宝生物工程有限公司;TGF-1 多克隆抗体、GAPDH 多克隆抗体,上海雅吉生物技术有限公司;兔抗人 IgG 抗体,北京百奥莱博科技有限公司。1.1.3 仪器荧光定量 PCR 仪(QuantStudio 5)、酶标仪(Mul-tiskan FC),美国赛默飞世尔公司。1.2 方法1.2.1 细胞培养与转染将细胞置于专用培养基中,37、5%CO2培养箱内培养;待细胞密度达 80%90%时,弃去培养上清,PBS 缓冲液
16、冲洗细胞 1 2 次,每次 5 min;0.25%胰蛋白酶消化细胞,至细胞大部分变圆并脱落,加少量培养基终止消化;加培养基至培养瓶内,轻轻吹打后,1 000 r/min 离心 4 min,弃上清;加 1 2 mL培养基重悬,放入培养箱继续培养至对数期,消化下细胞并调整浓度为 1 105个/mL,随后接种于24 孔板中;以 pcDNA3.1 质粒为载体构建 MIR4435-2HG 过表达质粒(MIR4435-2HG 过表达组),以无意义序列插入 pcDNA3.1 构建空白质粒(阴性对照组);利用 Lipofectamine 2000 试剂,将 pcDNA-MIR4435-2HG 和 pcDNA-NC 转染至 A549 细胞,37、5%CO2培养箱内培养,48 h 后采用实时荧光定量 PCR 技术验证转染效率。1.2.2 RT-PCR 反应取组织和对数生长期细胞,组织加 1 mL 裂解液,匀浆器匀浆处理,细胞直接在培养板中加入细胞裂解液后进行吹打;室温静置 5 min 后加入 0.2 mL氯仿并振荡 15 s,随后静置 3 5 min;4 下 12 000r/min 离心 10 min;吸
