1、第 51 卷第 2 期2023 年 1 月广 州 化 工Guangzhou Chemical IndustryVol.51 No.2Jan.2023HPLC-ELSD 法快速测定枸杞多糖的单糖组成及含量王琳琳,惠人杰(江南大学生命科学与健康工程学院,江苏 无锡 214000)摘 要:采用热水提取法对枸杞中的多糖成分进行提取,并用三氟乙酸对多糖提取液进行水解。利用蒸发光高效液相色谱(HPLC-ELSD)技术,使用单标葡萄糖溶液进行液相方法的优化,并对糖单标以及混标进样分析,确定标准品出峰时间。对多糖提取液以及水解液进样分析,根据标准品出峰情况,确定了水解液中枸杞多糖的单糖组成主要为葡萄糖、果糖,
2、含量分别为8.15%、4.75%。关键词:HPLC-ELSD;枸杞多糖;单糖组成分析中图分类号:R917 文献标志码:A文章编号:1001-9677(2023)02-0154-03 第一作者:王琳琳,硕士研究生,研究方向为药物分析。通讯作者:惠人杰,副教授,研究生导师,研究方向为药物分析。Determination of Monosaccharide Composition and Content ofLycium Barbarum Polysaccharide by HPLC-ELSDWANG Lin-lin,HUI Ren-jie(School of Life Science and He
3、alth Engineering,Jiangnan University,Jiangsu Wuxi 214000,China)Abstract:The polysaccharide in Lycium barbarum was extracted by hot water,and it was hydrolyzed bytrifluoroacetic acid.Using high performance liquid chromatography technology equipping with an evaporative lightscattering detector(HPLC-EL
4、SD),glucose standard solution was analyzed for the optimization of chromatographiccondition.A mixture of standard monosaccharide solution was then used for the retention time confirmation of 9 differentmonosaccharide.It was finally confirmed that glucose and fructose were the majority monosaccharide
5、 which composed theLycium barbarum polysaccharide,with the contents of 8.15%and 4.75%,respectively.Key words:HPLC-ELSD;Lycium barbarum polysaccharide;monosaccharide composition analysis枸杞子为茄科植物宁夏枸杞(Lycium barbarum L.)的干燥成熟果实,味甘性平,传统中医用其治疗虚劳静亏、腰膝酸软、眩晕、耳鸣、目昏不明等症状,以滋补肝肾、益精明目1。枸杞子富含包括多糖、多酚、生物碱、有机酸等在内的多种
6、天然生物活性成分,具有免疫调节、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤等多种生物活性,一直以来广泛应用于传统中药及各类营养食品中2-3。枸杞多糖是枸杞子的主要活性成分,研究结果显示,枸杞多糖除了具有枸杞一般免疫调节等生物活性,还具有神经保护、改善大鼠生殖功能、降低炎症介质表达等活性,并且有疗效良好、副作用小的优点4-5。对于枸杞多糖的质量研究是目前的热点之一,单一分析方法存在许多限制,多种分析方法联合使用可以更好的进行此项研究6-7。因此需要开发更多可靠的分析方法。本文首先对枸杞中热水提取的枸杞多糖进行水解,利用蒸发光高效液相色谱(HPLC-ELSD)分离技术,对单糖单标以及混标、多糖水解液进行分析。证实枸杞
7、多糖的主要单糖组分为葡萄糖和果糖,葡萄糖和果糖的检测限分别为 71.77、21.97 g/mL,定量限分别为 134.23、73.24 g/mL,枸杞多糖中单糖含量为葡萄糖 8.15%,果糖 4.75%。建立了快速定量枸杞多糖中单糖组分的分析方法,为后续枸杞多糖的成分分析以及研究提供方向。1 试剂与仪器1.1 试 剂枸杞,宁夏;超纯水,实验室自制;无水乙醇(分析纯)、甲醇(色谱纯),上海泰坦科技股份有限公司;三氯甲烷(分析纯)、正丁醇(分析纯)、三氟乙酸(分析纯),国药集团化学试剂有限公司;鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、果糖、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、半乳糖、乳糖标准品(分析标准品),阿拉丁试剂(上海)
8、有限公司。1.2 仪 器LC-20A 蒸发光高效液相色谱仪,日本岛津公司;ZNCL-TS250ML 磁力搅拌电热套,巩义市予华仪器有限责任公司;5427R 离心机,德国艾本德公司;BSA124S 精密电子天平,北京赛多利斯科学仪器有限公司;R-1001VN 旋转蒸发仪,郑州长城科工贸有限公司;DLSK-10/20 低温冷却液循环泵,郑州科泰实验设备有限公司。第 51 卷第 2 期王琳琳,等:HPLC-ELSD 法快速测定枸杞多糖的单糖组成及含量155 2 方法与结果2.1 溶液配制2.1.1 混合糖标准溶液配制分别称取鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、果糖、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、半乳糖、乳糖标准品 5
9、mg,加入 1 mL 水溶解得糖单标母液。分别取母液 0.5 mL 加入 4.5 mL 水稀释,得糖单标溶液。母液各取 100 L 混合,得糖混标溶液。2.1.2 标准曲线溶液配制称取 4.8 mg 葡萄糖标品溶解于 2 mL 水中,依次稀释得到1500、1200、600、300、150 g/mL 系列浓度溶液。称取 1.8 mg 果糖标品溶解于 2 mL 水中,依次稀释得到900、600、300、150、75 g/mL 系列浓度溶液。2.1.3 枸杞粗多糖提取称取10 g 枸杞果加入80 mL 水,在80 下搅拌提取 30 min后抽滤除去残渣,将上清液旋蒸至 20 mL,加入 80 mL
10、95%乙醇沉淀 24 h,收集沉淀并用无水乙醇洗涤,除去洗液,沉淀加入 15 mL 水溶解,加入 4 mLSevag 试剂 V(三氯甲烷)V(正丁醇)=3 1 搅拌 2 h 脱蛋白,离心除去沉淀,上清液旋蒸除去 Sevag 试剂,得 3 mL 粗多糖提取液 P。2.1.4 粗多糖水解及样品溶液制备将粗多糖提取液加入 2 mL 2 mol/L 的三氟乙酸,于 120 下充分反应 2 h,将反应液加入甲醇旋蒸至中性,加入水复溶,得 3 mL 粗多糖水解液 Ps。取 2 mL 干燥称重,得粗多糖提取物2.06 g。取 1 mL 粗多糖水解液 Ps 依次稀释 10、100、1000 倍得到Ps-10、
11、Ps-100、Ps-1000 样品溶液。2.2 液相方法优化以及标准溶液测定2.2.1 液相方法优化选择葡萄糖单标溶液进行液相方法优化,流动相为乙腈(A)-水(B)。分别选择三种液相条件,条件 a:等度 A B(V/V)=88 12;条件 b:等度 A B(V/V)=80 20;条件 c:时间(min)A B(V/V),T0=88 12,T3=88 12,T12=75 25,T15=75 25,T2388 12,T3088 12。通过对比葡萄糖的峰形、响应强度等,选择最佳液相方法。条件 a 中葡萄糖不出峰,条件 b 中葡萄糖峰形较差,条件 c 中葡萄糖峰形及响应较好,最终选择条件 c 为液相方
12、法。2.2.2 混合糖标准溶液色谱分析图 1 糖混标溶液色谱图Fig.1 Chromatogram of sugar mixed standard solution将“2.1.1”项下的糖单标溶液、糖混标溶液进样分析。根据单标出峰时间,确定混标色谱图中各色谱峰,见图 1,保留时间从小到大顺序依次出峰:鼠李糖(8.84 min)、木糖(10.96 min)、阿拉伯糖(12.37 min)、果糖(14.12 min)、葡萄糖(16.06 min)、半乳糖(16.67 min)、蔗糖(20.16 min)、麦芽糖(21.49 min)、乳糖(22.87 min)。各峰分离度均大于1.5,符合色谱分析
13、要求。2.2.3 单标糖标准曲线测定将“2.1.2”项下的葡萄糖、果糖系列浓度溶液分别进样分析,以峰面积为纵坐标,浓度为横坐标,作关系曲线。葡萄糖在 150 1500 g/mL 浓度范围内,峰面积与浓度呈线性相关,y=7596.52x+48843.82,R2=0.998。果糖在750 900 g/mL浓度 范 围 内,峰 面 积 与 浓 度 呈 线 性 相 关,y=8173.90 x-38749.21,R2=0.998。以信噪比 S/N=3 为检测限依据,信噪比 S/N=10 为定量限依据,分别计算葡萄糖、果糖的检测限和定量限,结果见表 1。表 1 葡萄糖和果糖标准曲线Table 1 Stan
14、dard curve of glucose and fructose葡萄糖果糖浓度/(g/mL)峰面积标准方程浓度/(g/mL)峰面积标准方程15011945983002324555600460446812009387509150011265642y=7596.52x+48843.82R2=0.998755763911501145089300238215260050279789007226793y=8173.90 x-38749.21R2=0.998检测限:71.77 g/mL检测限:21.97 g/mL定量限:134.23 g/mL定量限:73.24 g/mL2.3 样品溶液测定2.3.1
15、枸杞多糖水解液单糖组成鉴定将“2.1.4”项下 Ps-1000 样品溶液进样分析,色谱图见图 2。共有两个色谱峰,分别在 14.02 min,16.14 min 位置出峰,与葡萄糖、果糖标准品保留时间相符,该结果表明枸杞多糖中的单糖组成以葡萄糖和果糖为主。图 2 水解液 Ps-1000 色谱图Fig.2 Chromatogram of polysaccharide hydrolysate Ps-10002.3.2 枸杞多糖水解液单糖组成含量分析图 3 水解液 Ps-100 色谱图Fig.3 Chromatogram of polysaccharide hydrolysate Ps-100156
16、 广 州 化 工2023 年 1 月 将“2.1.4”项下 Ps-100 样品溶液按照“2.1.1”项下色谱条件进行分析,色谱图见图 3。测得葡萄糖、果糖的色谱峰面积分别为 6428401、3959922,代入标准曲线公式内,计算得粗多糖水解液 Ps 中葡萄糖浓度为 83.98 mg/mL,果糖浓度为48.92 mg/mL。则枸杞多糖提取物中单糖含量为:葡萄糖8.15%,果糖 4.75%。3 结 论枸杞多糖作为一种生物活性广泛的天然活性物质,在医药、食品等领域应用广泛。本文利用热水提取法对枸杞果中的多糖成分进行提取,并用三氟乙酸水解多糖得到粗多糖水解液。选择葡萄糖标准品进行液相方法的优化,最终选择梯度条件为:时间(min)A B(V/V),T0=88 12,T3=88 12,T12=75 25,T15=75 25,T23=88 12,T30=88 12,该方法下,混合糖单标准品峰形好、响应强度高、分离度良好,符合分析要求。选取两种糖标准品,进行标准曲线测定,得该方法下,葡萄糖、果糖分别在 150 1500 g/mL、750 900 g/mL 范围内线性关系良好,检测限低至 71.77、
