1、实验研究 基金项目：国家自然科学基金资助项目（）作者简介：李成蹊，男，研究方向：骨与四肢关节及其相关疾病的临床和研究，：通信作者：关智宇，男，主任医师，研究方向：骨伤科疾病的临床与研究，：，：基于网络药理学和分子对接方法探讨络石藤治疗类风湿关节炎的作用机制李成蹊，关智宇，蒋太平，刘志伦，刘昭明（贵州中医药大学，贵州 贵阳；贵州中医药大学第一附属医院骨科，贵州 贵阳）摘要：目的 基于网络药理学和分子对接方法探讨络石藤（）治疗类风湿关节炎（）的可能机制。方法 首先利用数据库检索中药“络石藤”的化学成分，并通过中药系统药理学数据库与分析平台（）的类药性指数（）和药物口服生物利用度（）划定范围，从该药
2、物成分中进一步筛选其中的有效活性成分。再通过、数据库获取尽可能全面的类风湿关节炎靶点基因，从而确定药物与疾病可能存在的交集靶点，以此构建络石藤中活性成分与类风湿关节炎靶点的关系网络，筛选治疗疾病的核心靶点。最后，对络石藤治疗类风湿关节炎的潜在作用靶点进行富集分析，同时对核心靶点及其结合性良好的活性成分进行分子对接。结果 最终筛选得到络石藤 个活性成分，其中包括木犀草素、植物甾醇、伊博格碱等；涉及 个类风湿关节炎相关靶点，核心靶点包括、等；分子对接显示络石藤某些活性成分与类风湿关节炎核心靶点具有较好的结合活性。结论 络石藤可以作用于疾病核心靶点，发挥抗炎、调节免疫功能及调控细胞凋亡等作用。关键词
3、：络石藤；类风湿关节炎；分子对接；网络药理学中图分类号：文献标识码：文章编号：（）：，（，；，）：（），（）（），药学研究 .1，.1：；现代医学认为，类风湿关节炎（，）是一种以侵袭性关节滑膜炎为主要症状的自身免疫系统疾病，其具体病因未明。特征为身体多关节的对称性、侵蚀性炎症，临床表现有关节晨僵、肿胀、疼痛及功能障碍等症状（最常见于手、足小关节），实验室检查可见血清类风湿因子阳性。如未得到恰当治疗，可能造成患者永久性骨质破坏并最终出现残疾，甚至累及脏器和神经系统而危及生命。目前临床常见的治疗 药物的主要局限性在于单一的靶向作用，这使得它们虽然可在短期内改善患者的临床症状，但长期的治疗效果往往欠
4、佳，且存在的不良反应和较大的经济负担使得很多患者不能维持用药。故而探寻并利用长效、低毒、价廉的中草药对 患者进行治疗，一直是近些年来临床研究的一个热点。属中医“痹症”“尪痹”范畴。中医理论认为痹症是由于体虚之人受到风、寒、湿、热等邪气侵袭，进而使经络闭阻，气血运行不畅，所谓“不通则痛”“不荣则痛”，最终导致肢体肌肉废用，关节红肿热痛、变形等症状的一种疾病。在长期的临床实践过程中，我国古代医家对此病有了较为系统的认知，在许多中医典籍中都有对类似病症的总结。黄帝内经最早提出了风、寒、湿三种外邪相合而致痹症，素问痹论曰：“风寒湿三气杂至合而为痹也”；对风湿的认知发展至宋代，有太平圣惠方云：“风湿腰痛
5、，连腿膝，顽痹不能运动”，太平惠民和剂局方又载：“体虚，风邪入血，肌肤顽痹”，都强调了体虚是痹病之根本原因，此后风湿之邪从外侵犯而成痹证。从古至今中医对 的治法也以祛风胜湿，通络止痛为主。中国药典记载络石藤为夹竹桃科植物络石（）的干燥带叶藤茎。味苦，性微寒。归心、肝、肾经。有祛风通络，凉血消肿的功效。中医常将其用于风湿痹症、腰痹筋挛、红肿热痛、跌扑损伤等治疗。本草纲目有载：“络石，气味平和，其功主筋骨关节风热痈肿”。通过长期的临床实践，人们发现在古今众多经方运用过程中，络石藤往往可有效延缓各种关节炎症的发展，改善患者临床症状。但由于中草药的成分混杂、机制不明等原因，其类似“黑箱理论”的运作形式
6、在多种临床疾病治疗过程中的作用依然受到质疑。本文旨在运用现代化的网络药理学和分子对接方法，分析络石藤所含的主要活性物质基础及其可能的作用机制，为明确络石藤对于 的治疗效果提供数据支持与理论依据。材料与方法 主要软件与数据库、语言、中药系统药理学数据库与分析平台（）、基因数据库、在线人类孟德尔遗传数据库（，）、数据库、蛋白质数据库、蛋白互作关系数据库、有机小分子生物活性数据库、蛋白质数据库（）。络石藤活性成分及作用靶点的筛选 在 中，以“络石藤”为检索词，获取络石藤已知的药物成分，将口服生物利用度大于等于（），化合物类药性大于等于（）设定为筛选标准，得到络石藤所含化合物中活性度较高的成分，之后利
7、用数据库进一步搜索这些成分所作用的靶点基因，再将药物所有的作用靶点导入 数据库进行比对、去重后，获得络石藤可作用的靶点基因名称。类风湿关节炎靶点的筛选在、两种数据库中同时检索关键词“”，将检索物种设定为“（人类）”，得到较为全面的 疾病人源靶点基因。“药物活性成分靶点疾病”网络的构建得到络石藤活性成分作用靶点与 潜在靶点基因后，运行 程序获取“药物疾病”交集靶点，再利用 语言将交集靶点输出为 图，运用 软件将络石藤及其活性成分、及其靶点基因之间的作用关系进行可视化分析。靶蛋白互作网络（）的构建检索 数据库，导入“药物疾病”交集靶点，生成蛋白互作网络（）后，将网络图保存为 格式的数据文件后导入到
8、 中进行筛选，得到络石藤活性成分作用的核心靶点基因。分子对接 首先使用 数据库搜索核心靶点对应的活性成分，导入 软件绘制活性成分的 结构，得到小分子配体文件。之后从 蛋白质数据库（）下载核心靶点的三维结构，用 软件删除配体并除水，得到蛋白受体文件。将二者导入 进行加氢修饰，设定搜索范围和评分参数，形成活性口袋。最后利用 软件进行分子对接。富集分析与 通路富集分析下载 程序包并利用 语言运行，对之前获取的“药物疾病”交集靶点进行 富集分析和 通路分析，将阈值设定为 以提高分析药学研究 .1，.1准确性，将分析结果按照涉及的靶点数目从高到低进行排列，选取 富集分析中生物过程（）、细胞组成（）和分子
9、功能（）的前 个条目及 通路富集的前 个信号通路，进一步探讨络石藤治疗 的生物学过程及其作用的信号通路。结果 络石藤活性成分及作用靶点 通过 数据库共检索出络石藤 个已知化学成分，再将 和 设置为筛选条件，最终得到 个活性度较高的化合物，可推测为络石藤活性成分（见表）。将活性成分导入 数据库，获取每个活性成分所作用的靶点基因，为避免不同活性成分存在重复的作用靶点，故将全部靶点基因利用 数据库进行比对、去重，获得 个络石藤治疗 的潜在靶基因名称。表 络石藤活性成分化合物 化合物名称生物利用度（）类药性（）谷甾醇豆甾醇牛蒡子苷去甲汉黄芩素木犀草素葡萄糖苷老刺木碱伊博格碱（）呋喃酮木犀草素 类风湿关
10、节炎靶点的筛选 在 数据库、数 据 库 中 检 索 关 键 词“”，物种设定为“”，得到 的人源靶点基因 个，结合络石藤治疗 的潜在靶点，运行 取“药物疾病”交集靶点，利用 语言输出为 图，发现 个络石藤作用靶点与类风湿关节炎重合的靶点基因。“药物活性成分靶点疾病”网络构建 将药物活性成分和疾病交集靶点导入 软件，得到“药物活性成分靶点疾病”网络图（见图）。网络图中共包含 个节点，其中六边形代表药物，矩形代表药物活性成分，椭圆形代表靶点，菱形代表疾病，连接线表示两个元素之间存在相互关系。根据网络中络石藤活性成分与疾病靶点连接度的多少筛选出排名前四的有效活性分子，分别为木犀草素、伊博格碱、谷甾醇
11、、豆甾醇，各有 个以上的靶点基因与这些成分发生作用，推测是络石藤在 治疗中起主要作用的活性成分，体现了中药多靶点的特性。靶蛋白互作网络（）的构建检索 数据库，将范围设为“”，物种设为“”，导入“药物疾病”交集靶点，初步生成 蛋 白 互 作 网 络（）后，调 整“”为 并隐藏游离靶点，其余参数为默认值，绘制更明晰的蛋白互作关系（见图），节点之间连线越粗代表互作关系越密切。将互作网络保存为 格式的数据文件，导入到 中对靶蛋白作用程度进行打分，筛选两次后得到 个蛋白互作网络核心基因（见图），分别为、，确定为络石藤活性成分作用的核心靶点。图 “药物活性成分靶点疾病”网络图 蛋白互作网络（）图 蛋白互作
12、网络核心基因筛选 分子对接 将筛选出的 个核心靶点与络石藤药学研究 .1，.1活性成分进行分子对接验证，其结果见表，可见木犀草素是与 个核心靶点对接的活性成分，运用 软件输出对接模式图（见图）。分子对接的结合能（）越小，表示配体与受体结合的越牢固。对接结果显示，络石藤活性成分与 核心靶点的结合能介于 与 之间（低于），表明活性成分与核心靶点具有较好的结合活性，预测结果比较可靠。表 活性成分与核心靶点对接结果核心靶点 号活性成分结合能 木犀草素木犀草素木犀草素木犀草素木犀草素木犀草素图 络石藤活性成分与 核心靶点对接模式 富集分析与 通路富集分析 将筛选出的 个“药物疾病”交集靶点进行 富集分析
13、与 通路富集分析，制作富集图形。本次 富集分析共显示 个生物过程（）、个细胞组成（）、个分子功能（），各取其中前 个条目进行可视化分析（见图）。交集靶点基因在 富 集 过 程 中 主 要 表 现 在 对 生 物 碱 的 反 应（）、肌肉细胞增殖（）、细胞对化学应激的反应（）、调节平滑肌细胞增殖（）、对金属离子的反应（）、腺体发育（）、对氧化应激的反应（）、对类固醇激素的反应（）、对活性氧的反应（）等生物过程；在 富集过程中主要表现为突触后膜（）、突触膜（）、突触前膜（）、细胞膜筏（）、细胞膜微区（）、细胞膜区（）等细胞组成；在 富集过程中主要表现在儿茶酚胺结合（）、蛋白偶联的胺受体活性（）、药
14、物结合（）、神经递质受体活性（）、肽结合（）等分子功能。图 络石藤治疗 的 富集分析本次 通路富集分析显示了 条通路，取前 个条目进行可视化分析（见图）。交集靶点主要富集于 信号通路、多种癌症相关通路、人巨细胞病毒感染、乙型肝炎、信号通路、信号通路、信号通路等，多为癌症、感染、炎症和免疫相关通路。图 络石藤治疗 的 通路富集分析 讨论经过 数据库筛选后，本次研究共得到络石藤中 个药动学特征良好的化合物作为潜在活性成分，通过“药物活性成分靶点疾病”网络图反映药学研究 .1，.1出其中木犀草素、伊博格碱、谷甾醇、豆甾醇 个成分可能为发挥 治疗作用的关键成分。木犀草素是一种天然黄酮类化合物，具有抗肿
15、瘤、抗炎、抗病毒、抗氧化、免疫调节等药理作用。等通过体内及体外实验证实了木犀草素具有较好的抗炎作用，其主要通过、通路发挥作用。徐强等认为木犀草素可以通过下调基质金属蛋白酶（，）的表达，防止软骨降解，促进新合成的细胞外基质（，）的积累，并抑制滑膜成纤维细胞增殖，最终缓解关节部位的炎症反应。部分关于急性痛风性关节炎模型大鼠的实验也证实了木犀草素缓解试验模型足踝关节肿胀的作用，是通过下调、等的水平达到的。谷甾醇是植物甾醇的重要组成成分，其作用于多种慢性疾病，具有抗炎、抗氧化及抗肿瘤等作用。等发现 谷甾醇可以通过抑制表皮细胞、巨噬细胞中炎症小体 的激活，来抑制 的产生及 信号通路的活化，从而显著减少细
16、胞中的、生成以起到抗炎作用。曾莉萍等发现 谷甾醇可使成骨细胞护骨素与破骨细胞分化因子的比值增高，发挥雌激素样作用，促进卵巢颗粒细胞分泌雌二醇，从而与骨膜上的雌激素受体结合，促进成骨作用以及抑制破骨作用来调节女性骨代谢的平衡。关于豆甾醇及伊博格碱的相关文献报道较少，豆甾醇的作用主要涉及抗癌方面，而伊博格碱主要用于阻断某些药物或毒品的依赖性，本文不做详细讨论。故推测木犀草素和谷甾醇为络石藤抗 的关键活性成分。而分子对接的结果也表明，在通过 网络筛选出的核心靶点基因、中，络石藤活性成分木犀草素与核心靶点具有较好的结合活性，进一步证实了络石藤药物成分可以与受体稳定结合并发挥治疗 的作用，为络石藤作用于核心靶点以干预 病情提供了更多数据支持。在筛选出的核心靶点基因中，又以、三个基因的自由度最高。（基质金属蛋白酶）信号通路是经典的炎性反应通路，有研究表明，对胶原诱导的关节炎大鼠给予 信号转导通路抑制剂后，与未给信号通路抑制剂的对照组相比，给药组在抑制滑膜炎症、骨质破坏和关节软骨破坏的方面有显著效果。说明该信号通路对炎症、增生和骨破坏这三大 病理过程均起到重要的调节作用。可通过磷酸化其下游底物来促进
