1、 1371 中国循证心血管医学杂志2022年11月第14卷第11期 Chin J Evid Based Cardiovasc Med,November,2022,Vol.14,No.11 论著 基于调控Calpain/GSK-3信号通路对抑制大鼠酒精性心肌病心肌细胞凋亡的研究王檬1，张洁1，赵继义1作者单位：1 150001 哈尔滨,哈尔滨医科大学附属第一医院心内科【摘要】目的 探讨特异性的抑制Calpain能否通过干预Calpain/GSK-3信号通路降低酒精致大鼠心肌细胞凋亡。方法 100只雄性Wistar大鼠随机分成生理盐水对照组（n=10）、酒精组（n=30）、酒精+Calpain-1
2、 抑制剂（ALLN）组（n=30）、酒精+二甲基亚砜溶剂（DMSO）组（n=30）。造模成功后分别通过心脏超声、HE染色、电镜、TUNEL检测、免疫组化染色法及Western blot法检测各组大鼠心肌细胞中Calpain-1、GSK-3（H-76）、caspase-9 p10、caspase-3 p17的表达情况。结果 与对照组相比，酒精组、酒精+ALLN组、酒精+DMSO组大鼠心脏左室舒张末期内径（LVDD）增大，左室后壁舒张末期厚度（LVPWD）增厚（P0.05），各组大鼠左室射血分数（LVEF）、左室短轴缩短率（LVFS）均位于正常范围（P0.05）。酒精组心肌纤维排列紊乱，结构消失，
3、心肌细胞固缩，细胞间质水肿，可见大量炎性细胞浸润，线粒体肿胀，酒精组及酒精+ALLN组心肌细胞凋亡率增加（P0.05），酒精组Calpain-1、GSK-3（H-76）、caspase-9 p10、caspase-3 p17蛋白表达水平上调（P0.05）。酒精+ALLN组与酒精组相比，LVDD略小，LVPWD相对稍薄（P0.05），病理改变较酒精组减轻，心肌细胞凋亡明显减少（P0.05），Calpain-1、GSK-3（H-76）、caspase-9 p10、caspase-3 p17蛋白表达水平下调（P0.05）。结论 大量酒精摄入可致大鼠早期酒精性心肌病模型中心肌细胞凋亡水平升高；Cala
4、pin-1抑制剂具有降低酒精诱导的心肌细胞凋亡的保护效应，其机制可能与Calpain对GSK-3的片段化导致其活性增高，上调凋亡相关蛋白的表达有关。【关键词】酒精性心肌病；凋亡；Calpain 1抑制剂；糖原合酶激酶-3；大鼠【中图分类号】R542.2 【文献标志码】A 开放科学（源服务）标识码（OSID）Inhibition of myocardial apoptosis based on controlling Calpain/GSK-3 signaling pathway in rats with alcoholic cardiomyopathy Wang Meng*,Zhang Jie
5、,Zhao Jiyi.*Department of Cardiology,First Affiliated Hospital of Harbin Medical University,Harbin 150001,China.Corresponding author:Zhao Jiyi,E-mail:Abstract Objective To investigate whether or not specific inhibition of Calpain reducing myocardial apoptosis induced by alcohol through interfering C
6、alpain/GSK-3 signaling pathway in rats.Methods Male Wistar rats(n=100)were randomly divided into control group(n=10),alcohol group(n=30),alcohol+Calpain-1 group(alcohol+ALLN group,n=30)and alcohol+DMSO group(n=30).After modeling successfully,the expressions of Calpain-1,GSK-3(H-76),caspase-9 p10 and
7、 caspase-3 p17 were detected by using cardiac ultrasound,HE staining,electron microscope,TUNEL detection,immunohistochemical staining(IHC)and Western blotting assay.Results The levels of left ventricular end-diastolic inner diameter(LVDD)and left ventricular posterior wall thickness at end diastole(
8、LVPWD)increased in alcohol group,alcohol+ALLN group and alcohol+DMSO group compared with control group(P0.05).There were disordered myocardial fibers,disappeared structure,cardiomyocyte pyknosis,intercellular substance edema,inflammatory cell invasion and mitochondrial swelling observed in alcohol g
9、roup.The cardiomyocyte apoptosis rate increased in alcohol group and alcohol+ALLN group(P0.05),and the protein expressions of Calpain-1,GSK-3(H-76),caspase-9 p10 and caspase-3 p17 were up-regulated(P0.05)in alcohol group.The levels of LVDD and LVPWD decreased(P0.05),pathological changes were relieve
10、d,cardiomyocyte apoptosis rate decreased significantly(P0.05),and protein expressions of Calpain-1,GSK-3(H-76),caspase-9 p10 and caspase-3 p17(P0.05)were down-regulated in alcohol+ALLN group compared with alcohol group.Conclusion High alcohol intake can increase cardiomyocyte apoptosis in rat model
11、of early alcoholic cardiomyopathy.Calapin-1 inhibitor had a protective effect of reducing alcohol-induced cardiomyocyte apoptosis,and the mechanism may be related to that Calpain can improve GSK-3 activity through GSK-3 fragmentation and up-regulate expressions of apoptosis-related proteins.Key word
12、sAlcoholic cardiomyopathy;Apoptosis;Calpain 1 inhibitor;Glycogen synthase kinase-3;Rats通讯作者：赵继义,E-mail:doi：10.3969/j.issn.1674-4055.2022.11.19中国循证心血管医学杂志2022年11月第14卷第11期 Chin J Evid Based Cardiovasc Med,November,2022,Vol.14,No.11 1372 （LVPWD）、左室射血分数（LVEF）、左室短轴缩短率（LVFS）。每一超声测定值取三个连续心动周期测量的平均值。1.2.3 组
13、织标本采集 取大鼠心肌组织，4%中性甲醛中固定24 h，按常规石蜡包埋后，各组织块做连续切片（厚度5 m），行苏木素-伊红（HE）染色。戊二醛固定组织用于电镜检查。剩余组织立即置于-80 冰箱冻存。1.2.4 组织化学检测 大鼠心肌组织常规脱水石蜡包埋切片（厚度4 m）HE染色观察心肌细胞形态学特征。CD31免疫组化染色（SP法）进行微血管标记染色。400视野下观察微血管密度。1.2.5 电镜观察各组大鼠心肌细胞的变化 心肌组织依次于2.5戊二醛、1锇酸中固定后，梯度浓度酒精处理，预制包埋块，超薄切片机将其切成7090 nm超薄切片，3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色。1.2.6 TUNEL法检测细胞
14、凋亡 心肌组织石蜡包埋后切片，厚度为4 m，二甲苯中脱蜡2次，每次10 min，浓度梯度酒精处理，滴加20 pg/ml不含DNA酶的蛋白酶K，常温作用30 min，PBS洗涤后加TUNEL检测液，37 度孵育60 min，加入抗荧光淬灭剂，荧光显微镜下观察并分析。每张切片随机选取10个非重叠400倍阳性视野，计数凋亡心肌细胞数及心肌细胞总数，心肌细胞凋亡指数=凋亡心肌细胞数/心肌细胞总数100%。1.2.7 Western Blot方法检测细胞样品中的蛋白 蛋白提取：用含蛋白酶抑制剂的RIPA蛋白裂解液抽提组织蛋白，BCA法绘制标准曲线定量蛋白浓度并稀释配平。Western Blot检测：SD
15、S-PAGE电泳法（10%分离胶、5%浓缩胶）分离蛋白并转移到PVDF膜，Calpain-1抗体（1:400，美国Santa Cruz公司）、GSK-3抗体（1:400，美国Santa Cruz公司）、Caspase-9抗体（1:400、美国Santa Cruz公司）、激活型Caspase-3抗体（1:400，美国Santa Cruz公司）、-actin（1:2000，美国Santa Cruz公司），4冰箱过夜，二抗孵育1 h后显影，实验重复四次，应用Quanty 1软件进行分析，将目的蛋白与-actin相比得到实验结果。1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件包进行数据分析，计量资
16、料以均数标准差表示。多组数据间均数比较采用F检验，多组数据间均数两两比较采用SNK检验。P0.05为差异具有统计学意义。2 结果2.1 心脏彩超测定各组大鼠的心脏超声指标 左室舒张末期内径（LVDD）、左室后壁舒张末期厚度（LVPWD）、左室射血分数（LVEF）、左室短轴缩短率（LVFS），比较各组大鼠心脏超声指标的变化。结果得知：与对照组相比，酒精性心肌病（ACM）指长期大量饮酒导致左心室扩张，左室收缩功能进行性受损的一种继发性心肌病，若不彻底戒酒及早期药物干预，最终发展为难治性心律失常和顽固性心力衰竭1-3。大量研究发现酒精摄入可引起心肌细胞凋亡4-6。细胞凋亡是在多种生理性或病理性刺激下，为维持内环境稳定，细胞信号转导通路激活启动细胞凋亡蛋白酶级联反应，导致细胞的程序化死亡。糖原合酶激酶-3（GSK-3）的激活促进线粒体途径诱导的内源性细胞凋亡7，进而激活半胱天冬蛋白酶-9（caspase-9）及下游半胱天冬蛋白酶的级联反应。钙激活中性蛋白酶（Calpain）的激活可片段化GSK-3并使其活性升高7。本实验通过酒精灌胃法建立早期大鼠酒精性心肌病模型，一方面检测大鼠心肌细胞凋亡水平
