1、第 1 期收稿日期：2021-09-15基金项目：黑龙江省自然科学基金联合引导项目（LH2020C084）；现代农业（奶牛）产业技术体系建设专项资金资助（CARS-36）。作者简介：鲁文赓（1973-），男，副教授，日本岐阜大学毕业，现主要从事间充质干细胞对奶牛繁殖障碍的防治方面的教学与研究工作。两种奶牛真皮成纤维细胞分离培养方法的比较鲁文赓1，袁思琦1，司琳清1，田春雨2，谢何昕1，周继伟1，金吉东3（1.黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆 163319；2.吉林省榆树市农业综合行政执法大队；3.科菲特饲料（长春）有限公司）摘要：为了比较两种体外分离和培养奶牛真皮成纤维细胞方法，采集奶牛蹄
2、部真皮组织，通过组织块贴壁法和双酶消化法（胰蛋白酶-型胶原酶）分离原代奶牛真皮成纤维细胞，通过传代培养进一步纯化并扩增。利用显微镜观察细胞形态及生长特性，MTT 法用于绘制细胞生长曲线，利用细胞免疫荧光技术检测其表面标志物，鉴定细胞纯度。倒置显微镜下观察，贴壁后第 6天有细胞爬出，形态多呈长梭形，排列紧密呈漩涡状或束状；双酶消化组第 2 天有长梭形细胞生长，混杂少量上皮细胞生长。生长曲线图表示，组织块贴壁组细胞生长速度较快。免疫化学荧光检测第四代奶牛真皮成纤维细胞，波形蛋白呈阳性表达，角蛋白-18 呈阴性表达，表示细胞纯度较高。两种方法均能分离出奶牛真皮成纤维细胞，与双酶消化法相比，组织块贴壁
3、法分离的细胞纯度更高，活性更佳，增殖周期更短，提示组织块贴壁法是分离培养奶牛真皮成纤维细胞的首选方法。关键词：奶牛；蹄叶炎；真皮成纤维细胞；组织块贴壁法；双酶消化法中图分类号：Q813.1文献标识码：A文章编号：1002-2090（2023）01-0041-05Comparison of two Methods for Isolation and Culture of Bovine Dermal FibroblastsLu Wengeng1，Yuan Siqi1，Si Linqing1，Tian Chunyu2，Xie Hexin1，Zhou Jiwei1，Jin Jidong3（1.Coll
4、ege of Animal Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319；2.Yushu City Agricultural Comprehensive Administrative Law-enforcement Unit；3.Cofeed Feedmill（Changchun）CO，LTD）Abstract：To compare two methods for isolation and culture of bovine dermal fibroblasts in vitro，
5、hooves-dermal tissue of dairy cowswere collected，using tissue block adhesion method and double enzyme digestion method（trypsin-Type collagenase）to isolateprimary bovine dermal fibroblasts，cells were further purified and amplified by means of subculture.The morphology and growthcharacteristics of the
6、 cells were observed by inverted microscope，and cell growth curves were drawn by MTT assay.Immunofluorescence chemical staining method was used to detect the surface markers.Under the inverted microscope，cells wereobserved on the 6th day after tissue block adherence，most of the cells were spindle-sh
7、aped with oval nuclei arranged and closely invortex or bundle shape.On the 2 th day，group of double enzyme digestion method were observed spindle-shaped cells mixed with asmall amount of epithelial cell growth.The growth curve showed that cell growth rate of the tissue block adherent group was faste
8、r.Thefourth generation of bovine dermal fibroblasts express vimentin but not express keratin-18 by immunochemical fluorescencedetection，indicating primary bovine dermal fibroblasts had high cell purity.Bovine dermal fibroblasts were successfully isolated bythe both methods，compared the other method，
9、cell isolated by tissue adherent method had high purity，better activity and shortergrowth cycle indicated that tissue adherent method was the preferred method of isolation of bovine dermal fibroblasts.Key words：dairy cows；laminitis；hoof-dermal fibroblasts；tissue block adhesion；double enzyme digestio
10、n奶牛蹄叶炎，是指一种浆液性、弥散性和无菌性炎症1-2，主要发生于真皮。根据临床表现，奶牛蹄叶炎主要包括急性、亚急性和慢性三种类别3，其中，亚急性蹄叶炎发生率较高且最难被发现，广泛流行在doi:10.3969/j.issn.1002-2090.2023.01.007第 35 卷第 1 期2023 年2 月黑 龙 江 八 一 农 垦 大 学 学 报Journal of Heilongjiang Bayi Agricultural University35（1）：4145Feb.2023黑 龙 江 八 一 农 垦 大 学 学 报第 35 卷现代规模化养殖的牛群和高产奶牛的泌乳初期4，引起跛行、肢蹄
11、疼痛、饮水障碍、产奶量降低、饲料转化率下降等一系列不良后果。在国外，泰国大型奶牛场临床性蹄叶炎发病率有 425。而在印度 Karaj 地区亚临床性蹄叶炎引发奶牛的跛足率为 82.76，在我国的新疆石河子地区牛蹄叶炎患病率为 7.887。由此可见，蹄叶炎对奶牛养殖业造成的损失巨大，阻碍了奶牛产业的健康高速发展。目前，尽管许多学者对奶牛蹄叶炎的病理生理学、组织学、代谢组学8和蛋白质组学9进行了研究，但对蹄叶炎发病机理的研究不足，有研究报道，饲喂高精料日粮的牛门静脉、肝静脉和颈静脉血浆中脂多糖浓度较正常饲喂的高10。大量临床病例显示，瘤胃酸中毒与奶牛蹄叶炎关系紧密，其能够导致瘤胃内革兰氏阴性菌释放出
12、内毒素并 进入全身循环，引起前列腺素级联反应。在以往的研究中，已经在奶牛和马体内成功建立了蹄叶炎模型，包括摄取超量的碳水化合物11、饲喂黑胡桃提取物12、血液中胰岛素含量上升的内分泌模型13和增加蹄承重的机械模型14。早在 1996 年，Pollitt15通过采取马蹄部真皮组织贴壁培养蹄真皮细胞，并体外培养外植体建立体外蹄叶炎模型。尚惠16将牛耳皮肤组织剪至匀浆状后涂抹至培养皿内，培养 45 d 有细胞迁出。由于体内各种系统器官相互影响，生理反应复杂多样，影响因素较多，无法实现控制变量单一来研究蹄部的变化，且体内研究成本较高，个体差异较大，因此对于进一步探索蹄叶炎体外模型仍有很高的需求。已有研
13、究报道，可以通过组织块贴壁法17和酶消化法18分离培养原代奶牛蹄真皮细胞，但对这两种方法的比较研究报道较少。因此，通过组织块贴壁法和双酶消化法提取原代奶牛真皮成纤维细胞（bovine dermal fibroblasts，BDFs）并鉴定，对比两种方法提取出细胞的细胞形态、增殖活性，讨论两种方法分离奶牛真皮成纤维细胞的优缺点，为之后的奶牛蹄叶炎体外模型的建立提供数据支持。1材料和方法1.1 主要试剂仪器主要试剂：DMEM 和 F12 购自中国赛默飞世尔科技有限公司；血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；0.25%胰蛋白酶、青霉素-链霉素、DAPI 和MTT 购自北京索莱宝科技有限公司；0.5
14、%型胶原蛋白酶购自合肥白鲨生物科技有限公司；波形蛋白和二抗购自北京博奥森生物科技有限公司；角蛋白 18购自美国 Abcam 公司。主要仪器：CO2恒温培养箱（Binder）、倒置荧光显微镜（BioTek）、低温高速离心机（Sigma）、超低温冰箱（松下集团，日本）、立式高温蒸汽灭菌锅（博讯公司，上海）、酶标仪（北京赛默飞公司）。1.2 采样采集健康成年奶牛蹄部，带回实验室，用灭菌手术刀采取奶牛蹄肉缘上部真皮皮肤，利用含青链霉素的生理盐水冲洗 2 遍后，放入干净带盖生理盐水烧杯中带入细胞间。1.3 组织块贴壁法分离培养 BDFs在超净台内，用 PBS 冲洗 3 次。去除皮下的结缔组织后，用剪刀将
15、组织剪成 1 mm1 mm1 mm 的大小，间隔 0.5 mm 均匀放置在培养皿内，倒扣放入培养箱以晾干水分。待组织块周围水分蒸干，缓慢加入少量完全培养液 DMEM/F12 含 10%的胎牛血清（FBS），1%的青链霉素（P/S）覆盖平皿底，24 h 后将培养液补全至 5 mL，3 d 后观察并换液。1.4 双酶消化法分离培养 BDFs在超净台内，用 PBS 冲洗 3 次。去除皮下的结缔组织后，用剪刀将组织块剪碎呈肉泥状，倒入 50 mL离心管内，加入胰蛋白酶（Trypsin，TE）吹打促进消化，倾斜放入 38.5 恒温培养箱消化 1 h。取出离心管，以 790g 离心 5 min，弃掉上清液
16、，加入 23 mL的 型胶原酶，吹打几次，放入 38.5 恒温培养箱消化 18 h，待组织完全被消化，肉眼可见少量纤维时进行阻断消化。之后用细胞筛过滤杂质，只留下细胞悬液进行离心，离心后弃掉上清，用 DMEM/F12 培养液重悬，铺于 6 cm 平皿内，放入 38.5 恒温培养箱培养，23 d 换一次液。1.5 奶牛 HDFs 传代培养细胞融合率达 80%时进行传代，用 PBS 洗涤 1遍，加 500 L 的 TE，放入 38.5 恒温培养箱内消化2 min，细胞由梭形变成圆形后，用培养液阻断消化，190g 离心 3 min，弃上清，用 DMEM/F12（含 10%FBS，1%P/S）培养液重悬，细胞计数后依据细胞量铺板。1.6 绘制 BDFs 生长曲线将两种奶牛 HDFs 的第四代细胞，以每孔 5103个细胞的密度铺至 96 孔板内，每隔 1 d 利用 MTT 法测量细胞增殖情况，测量 7 d，每组 3 个重复孔，取平42第 1 期均值，以天数为横坐标，吸光度为纵坐标绘制细胞生长曲线。1.7 BDFs 纯度鉴定利用荧光显微镜，通过免疫荧光细胞双染试验技术鉴定 BDFs 表面标记物波形
