1、GB/T27621-2011马鼻肺炎病毒PCR检测方法1范围本标准规定了马鼻肺炎病毒的PCR检测方法。本标准适用于马匹的流通和进出境检疫实施马鼻肺炎的现场检疫和后续监管工作。一步法PR检测技术适用于实验室细胞毒样品检测：巢式PCR检测技术适用于临床疑似样品及细胞毒样品检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实险室用水规格和试脸方法3缩略语下列缩略语适用于本文件。EHV:equine rhinopneumonitis,马传染性鼻肺炎。RNA
2、:ribonucleic acid,核糖核酸，CPE:cytopathic effect,.细胞病变。EB:ethidium bromide,溴化乙锭。EDTA:ethylene diaminetetraacetic acid,乙二胺四乙酸。SDS:sodium dodecyl sulfate,十二烷基磺酸钠。BHK-21:baby hamster kidney cell,.仓鼠幼肾细胞。PBS:phosphate buffer sodium,磷酸盐级冲液。4试剂和材料（试剂不经注明，均为分析纯）4.1水：符合GB/T6682中一级水的规格。4.2RNA酶A。4.3酚-三红甲烷。4.42%琼脂
3、糖凝胶：见A.1。4.5溴化乙锭(10g/L):见A.2。4.6DNA聚合酶(5U/L)。4.750TAE电冰缓冲液(pH8.5):见A.3。4.8 10XPCR Buffer(plus Mg+).4.92.5mmol/mL dNTP。4.10蛋白酶K(20mg/mL)。4.11BHK-21细胞。4.12含2%犊牛血清的MEM维持液。1GB/T27621-20114.130.3mol/1乙按纳。4.140.01mol/LPBS缓冲液(pH7.2):见A.4。4.15SDS。4.1610XTE缓冲液(pH8.0):见A.5。4.17无水乙醇。4.1870%乙醇。4.19Tris饱和酚(pH8.0
4、),4.20分子质量标准DL2000。5器材和设备5.1低温冷冻高速离心机。5.2倒置显微镜。5.3C02恒温培养箱。5.4普通冰箱和超低温冰箱。5.5组织研磨器。5.61.5mL离心管，5.7PCR扩增仪，5.8水平电泳槽。5.9微量移液器及吸头。5.10紫外照射仪或凝胶成像仪。6EHV的分离6.1采样取马流产胎儿病料的肺、脾或淋巴组织，疑似病驹呼吸系统的鼻咽拭子3根。6.2样品处理组织样品2g与2mL0.01mol/LPBS缓冲液置于组织研磨器中研磨匀浆，反复冻融3次：鼻咽拭子3根在2mL0.01mol/LPBS缓冲液中洗脱，反复冻融3次，离心取上清。6.3病毒增殖将毒种接种到单层的BHK-21细胞上，37吸附1h,加适量含2%的犊牛血清的MEM维持液，CO2恒温培养箱3？静置培养，利用倒置显微镜逐日观察CPE,48h后当CPE达85%以上时收毒，冻存于-70冰箱备用。7EHV的PCR检测7.1样品处理组织样品2g与2mL0.01mol/LPBS缓冲液研磨匀浆，反复冻融3次：鼻咽拭子3根在2mL0.01mol/LPBS缓冲液中洗脱，反复冻融3次，离心取上清。2
