1、GA/T1965-20218.2实时荧光定量PCR检测采用20 L qPCR反应体系：SYBR Premix Ex Taq(2X):10L,正向引物及反向引物各0.5L,DNA模板2L,纯水7L,反应参数见附录A中A.1。8.3PCR-CE毛细管电泳分离检测8.3.1样品PCR准备8.3.1.1取出冷藏的PCR-CE扩增试剂使其温度达到室温，轻弹混匀、离心。8.3.12准备扩增样品、阳性对照、阴性对照、PCR反应管，编号并进行扩增，PCR-CE增体系为20L,并参照A.2计算反应用量。8.3.13按照计算结果混合各种成分，混匀、离心，分装到透明薄壁PC管内。8.3.1.4将透明薄壁PC管放入扩
2、增仪中，见A.3中设定的程序运行。8.3.1.5扩增产物置于4保存。8.3.2毛细管电泳分离检测8.3,2.1在1mL甲酰胺中加入50L核酸分子量标记物，配制成上样混合液，涡旋混匀。8.3.2.2在96孔微孔板的样本测试孔中，加入10L上样混合物和1L扩增产物，3000r/min离心30s,去除气泡。8.3.2.395变性3min,立即放置冰上冷却3min,待测。8.3.2.4将加样变性后的96孔微孔板，置于遗传分析仪中进行电泳检测。详细电泳步骤参见毛细管电泳仪厂家配套的操作手册。8.3.2.5电泳完毕后，使用数据分析软件进行分析，获得扩增产物的片段长度。详细分析步骤参见分析软件厂家配套的操作
3、手册，9结果判断9.1根据实时荧光定量PCR仪的数据分析软件使用说明（以QuantStudio6and7 Flex Rea-TimePCR System Software,vl.0为例)，若Ci值小于或等于35，且呈现典型的扩增由线，则可判定为阳性结果，样品打增曲线参考A4,熔解h线参考A.5:若C值大于35，或无扩增信号，则可判定为阴性结果。9.2当扩增产物电泳分析结果，出现特异性片段的荧光峰，则表明该检测样本含有硅藻。样品检测结果参照A.6。不同批次检测的标准株阳性对照样本的特异性片段可能有长度差异，结果判断时按10.6判定。9.3当电泳分析结果未出现荧光峰时，样本仍有可能含有硅藻，需做进一步的检测分析。10注意事项10.1扩增试剂与检测试剂需分开保存：PremixTag酶于一20保存：荧光引物、核酸分子量标记物需4避光保存，长期保存需置于一20。10.2有效检测信号峰值应大于150RFU(RFU:相对荧光单位)以上。当检测信号峰值超过仪器检测最高國值时，应减少上样量重新电泳检测。10.3检验中应做已知标准藻株的阳性对照、空白对照和非溺死的人类DNA的阴性对照。10.4在阳性对照和阴性对照均正确的前提下，样品检验过程方可判定为可靠。3
