1、甘肃医药 2023 年 42 卷第 6 期Gansu Medical Journal，2023，Vol.42，No.6基础研究恶性肿瘤是一类严重威胁人类健康的疾病，放射治疗是治疗肿瘤的重要手段之一，临床上约 70%的恶性肿瘤患者需要放射治疗。但射线或者药物耐药性影响了肿瘤放化疗的效果1。化疗增敏剂能通过与化疗药物协同作用提高化疗药物的疗效。增敏药物属于抗癌药物的一个分支，通过克服肿瘤细胞对放射或抗癌药物的耐受性，提高对肿瘤细胞的杀伤效果，增强肿瘤药物或射线的作用2。目前常用的增敏剂主要有卤代嘧啶类增敏剂、铂类制剂、中药等。中药类制剂近年来广泛引起大家的关注3，中药类制剂通过改善血液循环、提高瘤
2、体的氧效应、降低肿瘤细胞的氧耗量以及增强对肿瘤细胞 DNA 的辐射损伤起增敏作用4。现有实验表明，当归多糖能明显降低 K562 细胞的 bcl-2 蛋白表达5。红芪多糖通过诱导S180 瘤细胞凋亡而抑制肿瘤的生长6。但关于当归、红芪提取物协同辐射的增敏作用的文献未见报道。p21 在细胞周期控制与肿瘤发生中有重要作用，通过协调细胞周期、DNA 复制与修复之间的关系，从而将肿瘤抑制作用与细胞周期控制过程紧密相连。放射引起肿瘤细胞 DNA 损伤，引起 p53 蛋白增高，从而启动 p21 基因转录，使 p21 蛋白含量增加，并与相关细胞周期调节因子结合，阻止受损的 DNA 进入 S 期复制，从而引起
3、G1 期的阻滞，通过解除放射后出现的 G1或 G2 周期阻滞，使受损的 DNA 进入 S 期或 M 期复制，可以使肿瘤细胞出现异常增殖而死亡。因此，检测细胞中 p21 蛋白含量，可预测肿瘤细胞增殖周期变化，并可作为治疗靶点抑制肿瘤生长。本研究通过观察当归、红芪提取物协同直线加速器对体外培养的人肝癌 SMMC-7721 细胞的作用，从细胞、分子水平探讨当归、红芪提取物增敏机制，为其临床应用提供科学依据。1材料与方法1.1细胞株人肝癌 SMMC-7721 细胞株由兰州大学提供。1.2主要仪器及试剂二氧化碳培养箱（BB16UV 德国 Heraeus 公司）、倒置相差光学显微镜（IX71 型，日本Ol
4、ympus 公司产品）、直线加速器、流式细胞仪、酶标仪、透射电镜等。新生牛血清（杭州四季青生物材料工程研究）、DMEM 培养基（北京赛默飞世尔生物化学制品有限公司）、胰蛋白酶消化液、MTT 溶液、PBS 溶液当归、红芪提取物对人肝癌 SMMC-7721 细胞辐射增敏作用王玥段惠春甘肃中医药大学第四附属医院/甘肃宝石花医院，甘肃 兰州 730060【摘要】目的：探讨当归、红芪提取物对直线加速器（X 射线）辐射后人肝癌细胞 SMMC-7721 的增敏作用。方法：96 孔板培养人肝癌细胞 SMMC-7721，设 9 个组，对照组（N）即正常对照组，纯辐射组（F）给以源皮距 100cm 4Gy 的 X
5、 射线，另设 3 个纯药物组（DH），设高（H：8mg/mL）、中（M：6mg/mL）、低（L：4mg/mL）三个药物浓度梯度，3 个辐射加药组（F+DH）和 1 个空白组（只有培养液无细胞）。每组设 6 个复孔。采用 MTT 法计算当归、红芪提取物对人肝癌 SMMC-7721 细胞辐射前后增殖活性的影响。流式细胞术检测不同组细胞的周期情况，透射电镜及倒置显微镜分别观察各组细胞结构变化，用蛋白印记法检测不同组细胞中 p21 蛋白表达情况。结果：MTT 法证明当归、红芪提取物具有抑制人肝癌细胞 SMMC-7721 增殖作用，对于辐射后的肝癌细胞具有很好的周期抑制作用。不同剂量当归、红芪提取物作用
6、于细胞 24h 后，抑制人肝癌细胞 SMMC-7721 增殖呈剂量依赖关系，药物浓度越高，抑制作用越显著。SMMC-7721细胞经辐射后，细胞的抑制率为 37.58，辐射后加不同浓度当归、红芪提取物（4mg/mL、6mg/mL、8mg/mL），联合作用对细胞的抑制率升高，分别为 45.27%、51.86%、59.34%，且呈药物浓度依赖关系，差异具有统计学意义（P0.01）。辐射组肝癌细胞较正常组细胞 G0/G1期细胞数明显增多，由 44.70升至 71.60（P0.01），S 期细胞减少，高浓度药物也可以使 G0/G1 期细胞比例有所升高（P0.01）。辐射加药组细胞 G0/G1 期阻滞最为
7、明显，并呈药物浓度梯度关系。高浓度药物组、辐射组细胞 p21 蛋白表达较正常组升高，辐射组+高浓度药物组细胞 p21 蛋白表达较辐射组明显升高。结论：当归、红芪提取物对于人肝癌 SMMC-7721 细胞具有很好的抑制作用，对经 X 线辐射后的细胞具有很好的增敏作用。【关键词】当归、红芪提取物；细胞周期；X 射线辐射；人肝癌 SMMC-7721 细胞；p21 蛋白中图分类号：R285文献标志码：A文章编号：1004-2725（2023）06-0485-05第一作者：王玥，女，主治医师，从事心律失常及冠心病等心血管疾病的药物及介入治疗工作通信作者：段惠春，女，副主任医师，从事肝硬化、肝癌等消化疾病
8、的诊治工作。E-mail：485DOI:10.15975/ki.gsyy.2023.06.012甘肃医药 2023 年 42 卷第 6 期Gansu Medical Journal，2023，Vol.42，No.6注：与 N 组相比，aP0.01表 1当归、红芪提取物对人肝癌 SMMC-7721 细胞增殖抑制作用（x-s）等。当归、红芪提取物（当归、红芪超滤膜提取物采用超滤膜分离技术提取，药材按 1 5 的比例混合，经过煎煮、粗滤、微滤、浓缩。浓缩后的每 mL 药液含生药量为1g，最后将浓缩后的药液经喷雾干燥仪喷成干燥粉末分装，干燥阴凉处贮藏备用）。1.3人肝癌 SMMC-7721 细胞培养细
9、胞培养置37、5%CO2的培养箱中，用含 10%新生牛血清以及浓度为 0.1%青链霉素的 DMEM 培养液培养，倒置显微镜观察细胞生长情况，2.5%胰蛋白酶消化传代，取对数生长期细胞用于实验。1.4MTT 法测定药物及辐射对 SMMC-7721 细胞的增殖活力影响采用 96 孔培养板，设 9 个组，对照组（N），纯辐射组（F）给以源皮距 100cm 4Gy 的 X 射线，另设 3个纯药物组（DH），设高、中、低三个药物浓度梯度，分别为 8mg/mL（DHH 组）、6mg/mL（DHM 组）、4mg/mL（DHL 组），3 个辐射加药组（F+DH，分别为 F+DHH 组，F+DHM 组，F+DH
10、L 组）和 1 个空白组（只有培养液无细胞）。每组设 6 个复孔。取对数生长期的 SMMC-7721细胞，浓度调整为 1105个/mL，每孔加入 150 L，37、5%CO2培养箱中培养，细胞完全贴壁后吸去上清液，N 组加入 DMEM 培养液 50L。DH 组分别加入不同浓度的药物 50L，F+DH 组为辐射后立刻加入不同浓度的药物 50L。各组细胞均培养 24 小时后，加入 MTT溶液（5mg/mL）20L，孵育 4h，吸取上清，加入 DMSO150L 震荡混匀，空白调零孔操作和上述一样。酶标分析仪 492nm 波长处测 OD 值，按下面公式计算细胞生长抑制率。细胞生长抑制率（%）=（N 组
11、 OD 值-加药各组 OD值）/N 组 OD 值100%。1.5倒置显微镜观察细胞形态的变化倒置显微镜下观察培养瓶内正常组细胞、辐射组（辐射后继续培养24h）及辐射加药组（辐射后立刻换成高、中、低浓度药物培养 24h 后）细胞形态变化，并拍照。1.6电镜观察细胞内部超微结构的变化不同组细胞经 0.25%的胰酶消化，用 PBS 洗两遍后，离心收集到EP 管中，加入固定液（含 2.5 的戊二醛等），过夜，再用10mg/mL 锇酸固定，逐级乙醇脱水，氧化丙烯浸透，树脂包埋，超薄切片机切片，于透射电子显微镜下观察细胞形态学变化并拍照。1.7药物协同 X 射线对体外培养的 SMMC-7721 细胞的作用
12、1.7.1流式细胞术检测细胞周期情况。各组细胞培养24h 小时后用胰酶消化，经 PBS 洗三遍，离心 1000 转5 分钟收集（15）106细胞 2mL 在 EP 管中加入 70%的预冷乙醇 2mL，吹散后 4保存，每管细胞加入碘化比定 10L，避光染色 30min 上机检测。1.7.2Western-blot 检测细胞中 p21 蛋白含量的情况。实验分组与前述相同，各组细胞经胰酶消化，用 PBS洗两遍，每瓶细胞加入 400L 含 PMSF 的细胞裂解液。裂解 30 min，在 4低温离心机 12000 转离心 5min，取上清液。提取蛋白后，用 BCA 试剂盒检测蛋白含量，每孔上样蛋白量保持
13、一致，电泳，经后转 PVEF 膜，封闭后加入 p21 一抗（1 200 稀释），4孵育过夜，加入二抗（1 5000 稀释）再孵育 2h，化学发光法显色。1.8数据统计处理采用 SPSS22.0 统计学软件处理本研究获取数据。符合正态分布的计量资料以均数标准差（xs）表示，组间比较采用 t 检验；计数资料以率（%）表示，组间比较采用 2检验。P0.05 为差异有统计学意义。2结果2.1当归、红芪提取物对 SMMC-7721 细胞增殖抑制作用影响不同浓度当归、红芪提取物作用于细胞24h，SMMC-7721 细胞 OD 值下降，说明药物对细胞生长具有抑制作用。低、中、高浓度药物对细胞的抑制率分别为
14、4.72、9.78、15.71，各组抑制率差异具有统计学意义，且呈药物浓度依赖关系（P0.01）。见表 1。2.2当归、红芪提取物联合辐射对人肝癌 SMMC-7721 细胞增殖抑制作用SMMC-7721 细胞经辐射后，OD 值下降，辐射对细胞的抑制率为 37.58，照射后加药细胞的 OD 值进一步下降，F+DHL 组、F+DHM组、F+DHH 组抑制率分别为 45.27%、51.86%、59.34%，且呈药物浓度依赖关系，差异具有统计学意义（P0.01）。见表 2。2.3当归、红芪提取物及辐射处理前后倒置显微镜下SMMC-7721 的形态学变化镜下正常组细胞形态规则呈花瓣状，密度较高，细胞膜完
15、整光滑（图 1）；辐射组细胞外形无明显改变，但密度明显下降（图 2）；辐射加低浓度药物组细胞密度进一步下降（图 3）；辐射加组别DH 浓度（mg/mL）nOD抑制率（）N060.9100.0140DHL460.8670.014a4.72aDHM660.8210.018a9.78aDHH860.7670.022a15.71a486甘肃医药 2023 年 42 卷第 6 期Gansu Medical Journal，2023，Vol.42，No.6图 10正常组（N）图 11辐射组（F）图 5辐射加高浓度药物组细胞形态（F+DHH）图 9辐射加高浓物药物组细胞形态（F+DHH）表 2 当归、红芪提
16、取物联合辐射对人肝癌 SMMC-7721 细胞增殖抑制作用（x-s）注：与 N 组相比，aP0.05；与 F 组相比，bP0.05中药物浓度组细胞形态不规则，细胞体积明显缩小（图4）；辐射加高浓度药物组细胞大多已成圆形，丧失本来细胞形态，核染色质边集（图 5）。2.4当归、红芪提取物及辐射处理前后透射电镜下SMMC-7721 的形态学变化正常组细胞形态规则，核染色质分布均匀，核仁清晰，细胞膜完整（图 6）；辐射组细胞核染色质密度增高，凝聚在核膜周边，细胞膜皱缩粗糙不完整（图 7）；高浓度药物组细胞核染色质边集、浓缩，线粒体肿胀，内质网扩张，出现空泡变性（图8）；辐射加高浓物药物组细胞线粒体进一步肿胀，空泡变性加重，细胞形态改变明显（图 9）。2.5流式细胞仪检测细胞周期分布辐射组肝癌细胞较正常组而言 G0/G1期细胞数明显增多，由 44.70升至 71.60（P0.01），S 期细胞减少，高浓度药物也可以使G0/G1期细胞比例有所升高（P0.01），辐射加药组细胞G0/G1期阻滞最为明显，虽然 F+DHL 组细胞 G0/G1期阻滞百分比与 N 组比无统计学意义，但 F+DHM 组与F+
