1、感染性疾病的分子诊断新方法及临床应用欧 静1，吴 桐1，董 晗1，刘 琳2,3，张湘燕1,2,3*(1遵义医科大学第一临床医学院呼吸与危重症医学科，遵义 563000；2贵州省人民医院呼吸与危重症医学科，贵阳 550000；3国家卫生健康委员会肺脏免疫性疾病重点实验室，贵阳 550000)摘要：感染性疾病仍是危害人类健康的主要问题之一，并可能造成暴发性流行性疾病，给全球卫生系统带来了极大的疾病负担。病原学的明确诊断是感染性疾病精准诊疗的先决条件，由于已知病原体的变异、新发病原体的不断出现以及机会性致病菌的增加，临床诊疗工作面临巨大挑战。然而传统的分离、培养方法作为病原学诊断的金标准，培养周期长
2、、敏感性低且污染率高，这促使分子诊断技术向快速、高效、自动化、数字化不断发展，并发挥了越来越大的作用。本文主要综述了近年来新的分子诊断方法在感染性疾病中的临床应用及面临的挑战。关键词：分子诊断技术；感染性疾病；病原微生物New molecular methods and clinical application inthe diagnosis of infectious diseasesOU Jing1,WU Tong1,DONG Han1,LIU Lin2,3,ZHANG Xiangyan1,2,3*(1Department of Respiratory and Critical Medic
3、ine,the First Clinical Medical College,Zunyi Medical University,Zunyi563000,China;2Department of Respiratory and Critical Medicine,Guizhou Provincial Peoples Hospital,Guiyang 550000,China;3The Key Laboratory of Pulmonary Immune Diseases,National Health Commission,Guiyang 550000,China)Abstract:Infect
4、ious diseases are the main cause of morbidity and death in patients around world,and maycause fulminant epidemic diseases,bringing a great burden to the global health system.A definite diagnosis ofetiology is a prerequisite for the accurate diagnosis and treatment of infectious diseases.With the var
5、iation ofknown pathogens,the continuous emergence of new pathogens and the increase of opportunistic pathogens,clinicians and scientists are facing growing diagnostic and therapuetic challenges in the field of infectiousdiseases now.However,as the traditional gold standard for pathogen diagnosis,the
6、 traditional isolation andculture methods are considered time-consuming,less sensitive and high risks of pollution contamination,necessitating the development of molecular diagnostic technology to be rapid,efficient,automated anddigitalized,which is playing more and more important role.This work mai
7、nly focuses on the clinicalapplication and challenges of new molecular diagnostic methods in infectious diseases in recent years.Key Words:molecular diagnostic techniques;infectious diseases;pathogenic microorganisms目前临床常用的检验方法如聚合酶链式反应、酶联免疫吸附实验等需要专业的技术人员、耗时的程序和昂贵仪器设备，且在病原学未知的情况下，经验性抗生素治疗难以避免，这可能会生命的
8、化学,2023,43(5):697-doi:10.13488/j.smhx.20230054收稿日期：2023-02-02基金项目：贵州省卫健委科学技术项目(gzwkj2021-088，黔科合基础-ZK2022一般254)第一作者：E-mail:*通信作者：E-mail:导致抗体效价降低、培养假阴性等情况，从而导致漏诊、误诊，治疗延迟或不足，住院时间延长、再入院，病死率增加等一系列临床不良结局，故上述方法已经不能满足目前临床需求。随着新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的不断传播，SARS-CoV-2感染相关疾病(corona virus disease2019，COVID-19)的持续蔓延，
9、截至2023年2月全球已累计确诊超6.71亿人，造成684万人死亡，严重危及人类生命安全，这促进了分子诊断方法的进一步发展。随着自动化分子平台、芯片技术、生物传感器等方面的整合研究不断深入，分子诊断技术在病原学微生物学领域展现出良好的应用前景，目前已广泛应用于感染性疾病的临床诊断，是一项被公认为有效和准确的诊断工具1。1 数字PCR技术1.1 聚合酶链式反应传统的PCR技术已充分应用于临床且提高了病原微生物诊断的数量及效率，是目前多数实验室及医院常用的检验方法，但由于开盖操作易导致“气溶胶”污染的可能，且仪器价格昂贵、应用单一，仅适用于定性和半定量研究，限制了聚合酶链式反应的广泛应用。在此基础
10、上，PCR技术不断发展以适应临床诊疗工作的需要(图1)。1.2 实时荧光定量PCR技术(real-time fluorescentquantitive PCR,FQ-PCR)第二代PCR技术通过荧光信号积累实时监测反应过程，利用标准品构建标准曲线，从而对检测样品进行定量分析2。FQ-PCR技术与常规PCR相比无开盖操作、不易污染，自动化、可重复性较好，可多位点组合和单管多重检测。但对干扰物的耐受性较低，扩增效率受抑制物影响导致灵敏度受限，出现检测结果的差异，这些都会不同程度限制FQ-PCR的应用3。1.3 数字PCR(digital PCR,dPCR)第三代PCR技术是精准医疗的新兴力量，适用
11、于高灵敏度的分子研究。将反应体系分配到大量独立的反应单元中进行扩增，检测其荧光信号，实现单分子的扩增及可视化研究，根据泊松分布和统计阳性信号来计算DNA拷贝数，从而对起始样品进行绝对定量4。根据分液方式的不同，dPCR可分为以液滴作为PCR单元的微滴dPCR(droplet dPCR，ddPCR)和基于微流控技术的微流体dPCR。谢凤欣等4和Yin等5报道了将微流控芯片与dPCR结合，可以同时检测SARS-CoV-2的两个特定靶点(开放读码框1ab和核壳蛋白N基因)和一个内参基因(核糖核酸酶P)，在115秒内即可识别出阳性信号，反应时间较FQ-PCR短。Yu等6的研究显示，FQ-PCR在阳性样
12、本中与ddPCR的检测结果没有差异，FQ-PCR的循环阈值(cycle threshold，Ct)与ddPCR的拷贝数呈正相关。在4个FQ-PCR检测报告为阴性的样本中，ddPCR检测呈阳性，说明ddPCR在低拷贝的病原体检测中具有潜在优势。与FQ-PCR相比，dPCR不依赖于标准曲线的建立、不受扩增效率的干扰，受背景DNA干扰较小，在低拷贝数的样品中检测敏感性较高。dPCR的局限性在于：动态检测范围较窄，通量低、成本高，技术复杂性高，且临床检测尚未建立标准的分析流程，这为未来dPCR的发展带来启示与挑战。2 等温扩增技术等温扩增技术(isothermalamplification图1PCR技
13、术的发展 698 生命的化学 2023年43卷5期综述technology，ITA)克服了传统PCR技术对热循环设备的依赖，通过不同的酶和特异性引物在恒定温度下进行快速扩增，从而实现高效的引物杂交，降低了检测成本和对实验室技术、仪器、环境的要求，适用于现场快速检测(point of care testing，POCT)平台的开发7。常用的ITA技术包括环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)、数字环介导等温扩增(digital LAMP，dLAMP)、重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplif
14、ication，RPA)、滚环扩增技术(rolling circle amplification，RCA)8、核酸序列依赖扩增技术(nucleic acid sequence-basedamplification，NASBA)9和链置换扩增技术(stranddisplacement amplification，SDA)等，具体见表110-12。2.1 LAMP技术LAMP技术是目前应用最广泛的ITA，具有快速、准确、操作简单等特点，在6065 的温度13下，反应时长为3060 min，可实现对目标序列6个区域的特异性扩增，扩增条件的耐受性较高，扩增效率可提高到普通PCR的十倍以上。一项无症状感
15、染的横截面研究指出，LAMP的敏感性优于定量逆转录聚合酶链式反应(quantitativereversetranscription PCR，qRT-PCR)，从而可以避免低水平感染的漏诊而导致慢性健康问题14。LAMP的局限性在于：高灵敏度伴随的气溶胶污染的风险；引物繁琐及可能存在的非特异性扩增；定量分析仍需标准曲线的建立等。这些也是LAMP目前还需要不断优化和发展的方向。2.2 dLAMP技术dLAMP技术通过样品自数化芯片以及微流控技术与LAMP的结合使核酸扩增技术成本降低、操作更加简易。与LAMP相同，dLAMP也存在非特异性扩增的问题。Rolando等15开发了具有高分辨率熔解温度的d
16、LAMP技术，使用dLAMP提取实时动力学信息，以确定数字阈值数据处理参数，从而最大限度地减少非特异性扩增，实现LAMP的优化。Hu等16开发了一种便携式微液滴荧光检测装置，在60 min内完成检测，满足低丰度样本的高灵敏POCT的应用。与其他核酸扩增方法相比，dLAMP对核酸含量低的样本灵敏度和特异度好，对抑制剂耐受性强17，在病原微生物、临床诊断领域展现出良好的应用前景。2.3 RPA反应RPA反应需3种关键酶，仅需520 min，通过双链DNA(double strand DNA，dsDNA)靶向结合同源序列，dsDNA构象改变启动DNA合成，对目标区域进行指数式扩增。Woo等18开发了一种等离子体等温重组酶聚合酶扩增阵列芯片，分析指出其灵敏度与4-pelx液相RPA和4-plex液相PCR技术相当或高出10倍，可用于快速灵敏的现场多重分子诊断。RPA的假阳性率及反应时间优于LAMP：前者相对较低的反应温度导致较小的气溶胶污染，且其相对简化的引物可实现病原体的快速多重检测。但因RPA扩增反应需大量酶类，需去除蛋白质表1等温扩增技术的比较方法温度()模板引物(条)酶优点缺点LAMP
